Abstract
O aquecimento global e eutrofização fazer alguns ecossistemas aquáticos se comportam como verdadeiros bioreactores que desencadeiam o crescimento de cianobactérias rápida e maciça; isto tem consequências económicas da saúde e relevante. Muitas linhagens de cianobactérias são produtores de toxinas, e apenas algumas células são necessárias para induzir danos irreparáveis ao meio ambiente. Portanto, as autoridades de água-corpo e as administrações necessitam de sistemas de alerta precoce rápidos e eficazes de fornecer dados fiáveis para apoiar as suas decisões preventivas ou curativas. Este manuscrito relata um protocolo experimental para a detecção em campo de linhagens de cianobactérias produtoras de toxinas, utilizando um chip de microarray de anticorpos com 17 anticorpos (ABS) com resolução taxonômica (CYANOCHIP). Aqui, uma fluorescente de imunoensaio sanduíche de microarray multiplex (FSMI) para o monitoramento simultâneo de 17 linhagens de cianobactérias frequentemente encontrada floresce em ecossistemas de água doce, alguns deles produtores de toxinas, é descrito. Um microarray com múltiplasPLE réplicas idênticas (até 24) do CYANOCHIP foi impressa sobre uma única lâmina de microscópio para testar simultaneamente um número semelhante de amostras. As amostras líquidas podem ser testados quer por incubação directa com os anticorpos (Abs) ou após a concentração de células por filtração através de um filtro de 1 a 3 | im. As amostras sólidas, tais como sedimentos e rochas terrestres, são primeiramente homogeneizado e dispersos por um ultrasonicator de mão em um tampão de incubação. Eles são, em seguida, filtrou-se (5 - 20 um) para remover o material grosseiro, e o filtrado é incubado com ABS. Reacções imunológicas são revelados por uma incubação final com uma mistura do Abs marcado com fluorescência 17 e são lidos por um detector de fluorescência portátil. Todo o processo leva cerca de 3 h, a maior parte corresponde a dois períodos de 1 h de incubação. A saída é uma imagem, em que as manchas brilhantes correspondem à detecção positiva de marcadores de cianobactérias.
Introduction
A detecção e monitorização de microrganismos em comunidades microbianas naturais complexos são cruciais em muitos campos, incluindo a biomedicina, a ecologia ambiental e astrobiologia. As cianobactérias são microrganismos procarióticos bem conhecidos por sua capacidade de formar flores (excessiva proliferação) de células em água doce. Eles estão por toda parte, e muitas espécies são capazes de produzir toxinas, levando não só a um risco potencial para a saúde humana, mas também a um impacto ecológico. A este respeito, é essencial para desenvolver métodos rápidos e sensíveis para a detecção precoce de cianobactérias e / ou suas toxinas no solo e na água. Para este efeito, uma lâmpada fluorescente imunoensaio sanduíche de microarray multiplex (FSMI) foi desenvolvido como uma ferramenta para os gestores da água para ajudá-los na tomada de decisões e, consequentemente, na implementação de programas adequados de gestão da água.
Uma grande variedade de métodos tem sido desenvolvida para detectar e identificar cianocélulas obacterial e cianotoxinas em solo e da água, incluindo a microscopia óptica, biologia molecular e técnicas imunológicas. Esses métodos podem variar muito na informação que fornecem. Técnicas microscópicas são baseadas na morfologia celular e a detecção de fluorescência in vivo a partir de cianobactérias pigmentos, tais como ficocianina ou clorofila a 1. Embora eles são métodos rápidos e baratos para em tempo real e monitoramento frequente que informam sobre o tipo e número de cianobactérias presentes em uma amostra, eles não dão informações sobre a toxicidade potencial. Além disso, eles exigem um certo nível de especialização, tendo em vista que muitas vezes é muito difícil distinguir entre espécies estreitamente relacionadas 2. Para superar essas limitações, microscopia de luz deve ser acompanhado de ambos os testes de rastreio biológicas e bioquímicas e métodos físico-químicos para a identificação e quantificação de cianotoxinas.
Métodos moleculares baseados em ter sido aplicada há décadas para detectar, identificar e quantificar as cianobactérias e cianotoxinas seus correspondentes graças à informação da sequência publicada nas bases de dados do genoma (por exemplo, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Entre estes métodos são aquelas com base na reacção em cadeia da polimerase (PCR), que exige a concepção de conjuntos de iniciadores para a amplificação de ADN e dependem do conhecimento prévio de sequências de DNA de diferentes espécies de cianobactérias. Embora a detecção de genes, como o operon ficocianina, leva à identificação precisa no nível de gênero, algumas espécies ou estirpes são detectadas comeste método. No entanto, os genes que codificam toxinas, tais como as que pertencem ao operão microcistina, facilitaria a identificação de toxinas nas amostras em que os produtores são escassos 5. No entanto, a detecção de marcadores de toxina por PCR não implica necessariamente a toxicidade no ambiente. Além disso, o conjunto de primers desenvolvidos para analisar toda a gama de espécies de cianobactérias e de toxina produtores presentes em uma amostra ainda está incompleta, e novos estudos devem ser feitos para identificar espécies desconhecidas. Outras técnicas moleculares são não-PCR à base, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH) e microarranjos de DNA.
Nas últimas duas décadas, a tecnologia de microarray ganhou importância em muitos campos de aplicação, especialmente no monitoramento ambiental. Microarranjos de DNA permitem a discriminação entre espécies e analitos 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, mas elas são consideradas muito trabalhoso e tarefas que envolvem múltiplos passos (por exemplo, o desempenho de microarray, extracção de ADN, amplificação por PCR e hibridação) demorado. Por essa razão, menos ensaios morosos baseados em anticorpos, tais como micromatrizes sanduíche e imunológicas competitivas, tornaram-se um método essencial e fiável de elevado rendimento para a detecção de múltiplos analitos ambientais 11, 12, 13. A capacidade dos anticorpos para reconhecer especificamente os seus compostos-alvo e a detecção de pequenas quantidades de analitos e proteínas, juntamente com a possibilidade de produzir anticorpos contra praticamente qualquer substância, fazer micromatrizes de anticorpo uma técnica poderosa para fins ambientais. Além disso, a capacidade de atingir múltiplas análises em tãoingle ensaio, com limites de detecção na gama de ppb a ppm, é uma das principais vantagens deste método 14.
Biossensores baseados em anticorpos provaram ser ferramentas sensíveis e rápidos para a detecção de uma ampla gama de patogénios e toxinas na monitorização ambiental 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Enquanto os métodos de DNA envolve várias etapas, os microarrays à base de anticorpos só exigem uma preparação de amostra pequena que é baseado principalmente em uma etapa curta lise num tampão solução adequada. Delehanty Ligler e 15 relataram a detecção simultânea de analitos e proteínas bacterianas em misturas complexas com base em um imunoensaio sanduíche de anticorpo capaz de detectar uma concentração de proteína de uma 4 ppbd 10 4 cfu / mL de células. Szkola et ai. 21 desenvolveram uma micromatriz multiplex barato e fiável para a detecção simultânea de pequenas proteotoxins e toxinas, compostos que pode ser utilizado em armas biológicas. Eles detectadas concentrações de toxina de ricina, com um limite de detecção de 3 ppb, em menos de 20 min. Recentemente, o CYANOCHIP, um biossensor baseado em microarray de anticorpos para a detecção in situ de cianobactérias tóxico e não tóxico, tem sido descrito 22. Este microarray permite a identificação de potenciais florações de cianobactérias, principalmente em ambientes aquáticos, que são difíceis de identificar microscopicamente. O limite de detecção do microarray é de 10 marco 02-10 células para a maioria das espécies, transformando este biossensor em uma ferramenta eficaz para a detecção multiplex e identificação de cianobactérias, mesmo ao nível de espécie. Todas essas propriedades fazem o Antibody técnica de microarray, e particularmente o método apresentado neste trabalho, um método mais rápido e mais simples em comparação com as técnicas acima mencionadas.
Este trabalho apresenta dois exemplos de experiências que utilizam um biossensor baseado em microarray de anticorpos para detectar a presença de cianobactérias, em amostras de solo e água. É um método simples e confiável com base em um formato de imunoensaio sanduíche que exige muito pequenos volumes de amostras e preparação muito básico amostra. O método requer um curto período de tempo e pode ser facilmente realizada no campo.
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Protocol
1. Preparação dos imunogénios
- Cresça cada estirpe de cianobactérias no meio de cultura correspondente, sob condições descritas na Tabela 1.
NOTA: O meio de crescimento e condições de cultura de cada estirpe de cianobactérias estão listados na Tabela 1. Todas as linhagens de cianobactérias, com a excepção de K17, que pertencem ao grupo de Antonio Quesada da Universidade Autonoma (Madrid, Espanha). O anticorpo contra rubescens Planktothrix foi gerado a partir de uma amostra natural da flor monospecific desta cianobactéria de Vilasouto reservatório (norte da Espanha). - Quantificar o número de células utilizando uma câmara de contagem de células por microscopia óptica para obter aproximadamente 10 8 células / ml a partir de uma cultura em fase de crescimento exponencial tardia ou estacionária.
- Células colheita a partir de 5 ml de cultura por centrifugação a 2000 xg durante 5 min.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em uma cuba de 10 mle com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS 1x) para se obter cerca de 10 8 células / mL.
- Homogeneizar e lisar as células da suspensão por sonicação durante 5 ciclos, 30 s cada, com uma pausa de 30 a 60-s em gelo, usando um processador ultra-portátil de mão ou por imersão do tubo para dentro do banho de água de um disruptor celular em amplitude máxima (30 kHz).
- Repita os passos de 1,3-1,5 para cada estirpe de cianobactéria.
NOTA: A sonicação produz rompimento celular e liberação do conteúdo celular. Enquanto proteínas e polissacáridos são bons imunogénios, moléculas específicas, tais como lípidos e ácidos nucleicos, não induzem uma resposta humoral imunogénico por si só. Por isso, eles devem ligar-se a transportadores, tais como polissacáridos ou proteínas, para aumentar a complexidade molecular. Além disso, a sonicação liberta material intracelular que podem desencadear a produção de anticorpos.
2. Produção de anticorpos policlonais Anticorpos
- Prepare o primeiro immdose de unogen por mistura de 0,5 mL de lisado celular ultra-sons, obtido no passo 1.5 com 0,5 ml de adjuvante completo de Freund. Entregá-lo ao operador de uma instalação de animais para a produção de anticorpos policlonal de coelho.
- Prepare mais três doses como antes para ser posteriormente utilizada como impulsos de memória no processo de produção de anticorpo por mistura de 0,5 mL do mesmo homogenato / lisado obtido no passo 1.5 com 0,5 ml de adjuvante incompleto de Freund. Dá-los para a instalação de animal para cumprir o processo de produção de anticorpos.
- Repita os passos 2.1 e 2.2 para cada novo processo de produção de anticorpos.
NOTA: Normalmente, a produção de anticorpos é confiada a instalações para animais especializados ou empresas, porque licenciamento e formação adequada são obrigados a trabalhar com animais. As empresas de fornecer uma medida da quantidade de anticorpos específicos para o antigénio presente na amostra de soro relativamente ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA).
3. Anticorpo Purificação
- Purifica-se a fracção de imunoglobulina G (IgG) a partir de ambos os sistemas imunológico e o soro pré-imune recolhidas no passo 2 por uma proteína de cromatografia de afinidade. Alguns kits de purificação comerciais, com base em sistemas de cartucho, funcionam bem; siga as instruções do provedor.
- Quando o kit de purificação não proporcionam um sistema de dessalinização, mudar o tampão após a eluição dos anticorpos purificados a 0,1X PBS, quer por diálise ou através de dispositivos de filtros centrífugos com um 100-kDa (ou menor) tamanho de poro da membrana.
- Determinar a concentração de anticorpo através da medição da absorvância a 280 nm ou através de métodos colorimétricos, tais como 23 Bradford, Lowry 24, ou ácido bicinconínico (BCA) 25.
NOTA: É importante evitar a inclusão de grupos amina no tampão de eluição (por exemplo, tampões TRIS) porque competem com o anticorpo para se ligar a superfícies sólidas activadas com grupos epoxi. Depois purification, é importante testar a actividade de anticorpos por ELISA.
4. Fluorescência Rotulagem de anticorpos
- Rotular os anticorpos purificados obtidos no ponto 3, com um fluorocromo (por exemplo, um corante fluorescente vermelho-distante) por dissolução de um frasco que contém o corante comercial para rotulagem de 1 mg de proteína em 100 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Adicionar 2 mL do corante dissolvido para cada preparação de anticorpo numa concentração de 2 mg / ml num volume final de 50 mL em solução salina tamponada com fosfato 50 mM (pH 8,5).
- Manter as reacções de rotulagem, sob agitação contínua durante 1 hora à temperatura ambiente e a 1200 rpm em uma plataforma vibratória.
- Purifica-se os anticorpos marcados por cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, utilizando um gel com uma gama de fraccionamento entre 1,5 e 30 kDa preso em uma coluna), seguindo as recomendações do fornecedor.
- Medir a absorvância a 280 nm e a 650 nm em eluatos e calcular o labeeficiências ling seguintes recomendações do fornecedor.
NOTA: até 50 x 50 mL reacções de rotulagem anticorpo pode ser feito com um único frasco do corante fluorescente para rotulagem de 1 mg de proteína. Recomenda-se a cobrir os tubos com uma folha de alumínio ou, em alternativa, o uso de tubos opacos 0,5 mL, para evitar processos de têmpera após a etapa 4.3. Para os anticorpos IgG, rotulagem óptima é conseguida com 7/3 mol de corante por cada mole de anticorpo.
Produção 5. CYANOCHIP
- Os anticorpos e controles em solução de impressão
- Preparar 30 L de cada anticorpo purificado em solução de impressão por mistura de cada anticorpo a 1 mg / ml num tampão de impressão proteína 1x comercial com 0,01% (v / v) de Tween 20 (um detergente não iónico), tudo como concentrações finais.
NOTA: Como alternativa, uma solução de anticorpo pode conter 20% de glicerol, 1% de sacarose (ou tre-halose, como um conservante), e 0,01% (v / w) (v / v) de Tween 20 em tampão de carbonato (pH 8,5). - Preparar 30 mL da solução de impressão como controlos: (a) tampão de impressão 1x proteína com 0,01% (v / v) de Tween 20, (b) proteína A de soro pré-imune purificada em 1 mg / mL em 1x tampão de impressão proteína com 0,01% (v / v) de Tween 20, e (c) de albumina de soro bovino (BSA) a 1 mg / mL em 1x tampão de impressão proteína com 0,01% (v / v) de Tween 20.
- Preparar 30 uL de um soro pré-imune marcado por fluorescência, purificada em diferentes concentrações (por exemplo, a partir de 50 ug / mL a 1 ug / mL) em 1x tampão de impressão proteína com Tween 20, tal como no passo 5.1.1. Estas amostras serão utilizadas como marcadores de quadro fluorescentes e para a quantificação da fluorescência relativa depois de manchar.
- Adicionar 30 uL por poço das soluções de impressão preparados nos passos 5.1.1, 5.1.2, e 5.1.3 para a mais alta qualidade microplacas de 384 poços para a fabricação de microarray, tal como polipropileno.
NOTA: tampão de impressão de proteína aumenta a qualidade e a estabilidade dos anticorpos, e Tween 20 homogeneíza mo pontorphology e constrói-se o acoplamento proteína-se. Recomenda-se para manter a microplaca de 384 cavidades a 4 ° C antes da utilização. Armazená-lo a -20 ° C durante longos períodos de tempo. Polipropileno tem baixa DNA, proteína, extrato celular e pequena molécula intrínseca ligação.
- Preparar 30 L de cada anticorpo purificado em solução de impressão por mistura de cada anticorpo a 1 mg / ml num tampão de impressão proteína 1x comercial com 0,01% (v / v) de Tween 20 (um detergente não iónico), tudo como concentrações finais.
- Impressão anticorpo sobre uma lâmina de microscópio
NOTA: Imprimir os anticorpos em lâminas de microscópio ativadas utilizando diferentes plataformas de matriz, como contato, split-agulha, ou dispositivos sem contacto, como impressoras piezoeléctricos ou tecnologias "jato de tinta". Neste trabalho, o CYANOCHIP foi rotineiramente impresso por contacto utilizando um sistema robótico (arrayer) capaz de detectar quantidades nL dos anticorpos na escala de ^ M.- Definir as condições ambientais da sala de impressão aos 20 ° C e 40 - 50% de humidade relativa.
- Configure os substratos de slides (por exemplo, 75- x 25 mm slides de microscópio activada com epoxi de vidro) para executar várias arra anticorpos idênticosys em cada slide.
- Identificar cada anticorpo purificado, incluindo controles e do quadro de referência, em um teste padrão do ponto triplicado; Sob estas condições, as manchas são de 180 - 200 um de diâmetro.
- Após a impressão, deixe os slides durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente para deixá-los secar, e depois armazená-los a 4 ° C; para trabalhar no campo, as lâminas podem ser transportadas e armazenadas à temperatura ambiente durante vários meses.
NOTA: O CYANOCHIP é impresso em um formato de microarray local triplicado com 3 x 8 microarrays idênticos por lâmina ou 9 matrizes idênticas em um formato de microarray 1 x 9. Cada tamanho da matriz não deve ser maior do que as dimensões da câmara de reacção para uma junta 24 cavidades (normalmente 7,5 x 6,5 mm de uma câmara de hibridação 3 x 8). - Antes de usar o microarray para analisar amostras ambientais, FSMI utilizar para determinar a diluição de trabalho de cada anticorpo em uma curva de titulação. Para cada anticorpo, usar uma concentração padrão do correspondente immunogen (10 abril 3-10 células / ml) e diluições em série do anticorpo fluorescente (entre 1: 500 e 1: 32000). A concentração óptima de anticorpo corresponde a 50% da intensidade máxima do sinal obtido na curva de titulação. Além disso, a sensibilidade e especificidade de cada anticorpo deve ser determinada, como descrito em Blanco et ai. 22.
6. Preparação da Ambientais multianalitos Extractos para o imunoensaio fluorescente Sandwich Microarray (FSMI)
- Multianalitos extracto de uma amostra líquida
- Tome 1 - 100 mL da amostra de líquido com uma seringa estéril (por exemplo, a água da costa de um reservatório de água); a quantidade de amostra é grandemente dependente da concentração potencial dos alvos.
- Concentram-se as células fazendo passar a amostra de água através de um tamanho de poro de 3 um, de 47 mm de diâmetro filtro de policarbonato; uma concentração celularentre marco 10-agosto 10 células / mL é desejável para a detecção positiva, mas a concentração real é desconhecida.
- Recuperar a biomassa recolhida no filtro com 1 mL de uma solução salina tamponada com Tris modificado, Tween 20 reforçado (TBSTRR; 0,4 M de Tris-HCl (pH 8), NaCl 0,3 M, e 0,1% de Tween 20) por raspagem com uma espátula para um tubo de 15 ml.
- Homogeneizar e desagregar usando um processador ultra-sónico de mão, tal como descrito na etapa 1.5, ou apenas por pipetagem para cima e para baixo várias vezes; este prepara a amostra para análise por microarray.
- Extrato multianalitos a partir de uma amostra sólida
- Pesar até 0,5 g da amostra sólida (por exemplo, rocha, solo ou sedimentos) em um tubo de 10 ml e adiciona-se a 2 mL de TBSTRR.
- Sonicar por imersão da sonda de ultra-sons no tubo, por imersão do tubo para dentro do banho de água de uma buzina sonicadora poderoso, ou usando um sonicador de mão. Realizar pelo menos 5 x 30-sciclos a 30 kHz, parando por 30 s, enquanto em gelo.
- Filtrar para remover a areia, argila e outro material grosseiro, com uma seringa de 10 mL acoplado com um diâmetro de 10 a 12 mm, suporte de filtro de nylon de tamanho de poro de 5 a 20 mícrons. Empurrar a amostra através do filtro para um tubo de 1,5 mL. Se os ácidos gordos saturados de filtro, agite a suspensão na seringa e levá-la para um novo; este se prepara o material filtrado para o imunoensaio (passo 7).
NOTA: A capacidade de tamponamento da TBSTRR depende do tipo de amostra. É importante realizar o imunoensaio imediatamente após a preparação do extracto do ambiente para evitar o efeito de degradação enzimática nos analitos. Alternativamente, adicionar inibidores de protease para o extracto do ambiente e congelação a -80 ° C até ao passo seguinte.
7. fluorescente Microarray imunoensaio tipo sanduíche (FSMI)
- O bloqueio da CYANOCHIP
NOTA: Imediatamente antes da utilização, tratar o pMPRESSO desliza para bloquear todos os grupos epoxi livres na corrediça e para remover o excesso de anticorpos não ligados covalentemente.- Mergulha-se o microarray em Tris-HCl 0,5 M (pH 9) com 5% (w / v) de solução de BSA sobre uma superfície limpa (por exemplo, placa de Petri ou um tubo de 50 mL) com agitação suave a partir de uma plataforma oscilante durante 5 minutos. Alternativamente, coloque o slide para baixo em uma 100 a 200 mL gota da solução acima, com os pontos de microarray que enfrenta. Deixe por 3-5 minutos e depois prosseguir.
- Com cuidado, pegue o slide usando uma pinça com ponta de plástico; tentar evitar zonas de microarray tocantes. Eliminar o excesso de líquido por suavemente batendo o slide em uma toalha de papel. Mergulhá-lo em Tris-HCl 0,5 M (pH 8) com 2% (w / v) de solução de BSA durante 30 min com agitação suave a partir de uma plataforma oscilante.
- Seca-se a corrediça através da realização de uma curta centrifugação (200-300 xg durante 1 min) utilizando um microcentrífuga comercial adaptado para lâminas de microscópio. Alternativamente, secar o slide por suavemente batendo ontoa toalha de papel.
- A incubação do extracto de amostra multianalitos com o microarray
- Configure o slide em uma cassete hibridação microarray comercial com 24 poços para várias microarrays; siga as instruções do provedor.
- Depois de corrediça e uma cassete de montagem, pipeta-se para 50 mL do extracto de amostra ou de uma diluição em que TBSTRR em cada poço da cassete.
- Repetir o passo 7.2.2 para cada amostra a ser analisada.
- Como um controlo em branco, pipeta 50 ul de tampão TBSTRR em pelo menos duas cavidades separadas da cassete.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 hora com mistura por pipetagem a cada 15 minutos, ou deixando-a sob agitação suave. Alternativamente, incubar durante 12 horas a 4 ° C.
NOTA: Use outras juntas de incubação como uma função do padrão de microarray. O tempo e a temperatura da incubação no passo 7.2.5 são parâmetros empíricos que, normalmente, dependem da afinidade de ligação e Kinetics de cada emparelhado antígeno-anticorpo.
- Lavando
- Retirar as amostras colocando a cassete para baixo e com cuidado bater-lo em um papel limpo, absorvente.
- Lavar os poços por adição de 150 uL de TBSTRR a cada um, e eliminar o tampão, como acima.
- Repita o passo 7.3.2 mais três vezes.
- A incubação com anticorpos detectores fluorescentes
- Adicionar 50 uL de uma mistura de anticorpo que contém os anticorpos anti-cianobactérias-estirpe 17, cada uma marcada com o fluorocromo em TBSTRR com 1% (w / v) de BSA. Determinar a concentração de cada anticorpo fluorescente na mistura (0,7-2 ug / ml) através da realização de experiências de titulação de cada par antigénio / anticorpo 22.
- Incubar durante 1 h à temperatura ambiente, tal como descrito no passo 7.2.5, ou durante 12 h a 4 ° C.
- Lavar os anticorpos fluorescentes </ Strong>
- Remover os anticorpos não ligados fluorescentes, tal como no passo 7.3.
- Desmonte a fita e mergulhe o slide em 0,1x PBS (por exemplo, em um tubo de 50 ml) para uma lavagem rápida.
- Seque o slide como na etapa 7.1.3.
8. Verificação de Fluorescência
- Digitalizar o slide para a fluorescência no pico máximo de emissão de fluorescência para o corante fluorescente vermelha distante em um scanner para fluorescência. Levar várias imagens dos microarrays em diferentes parâmetros de digitalização, em geral, diminuindo o valor de ganho laser.
Nota: Evite manchas saturada (> 65.000 contagens de fluorescência) -eles estão fora de escala e podem introduzir erros de quantificação.
9. Processamento de Imagem e Análise de Dados
- Use um software comercial para análise de imagem e quantificação; o software fornece medições da intensidade de fluorescência (FI; mediana ou média de todos os pixels de um único ponto) para eACH local de toda a micro-arranjo. Subtrair o fundo local ao redor dos pontos: FI = FI local - FI fundo local.
- Guardar os dados FI e abri-los usando um programa de planilha.
- Utilizar os valores obtidos para as matrizes em branco como controlo negativo para identificar e rejeitar os falsos positivos. Aplique a seguinte equação para calcular o FI para cada local de anticorpos: FI = (amostra FI - FI em branco), onde FI amostra = ponto FI - FI fundo local nos microarrays correr com extractos de amostras e FI em branco = ponto FI - FI fundo locais nas micromatrizes em branco.
- Aplicar um limiar de corte adicional de 2 a 3 vezes a média da IF de toda a micro-arranjo para minimizar a probabilidade de falsos positivos; Isto é especialmente relevante para as imagens de microarray de baixa qualidade e baixos rácios de sinal-para-ruído.
- Criar parcelas e / ou realizar uma análise mais aprofundada, se necessário.
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Representative Results
Este trabalho descreve um teste de imunoensaio em multiplex para a identificação simultânea das espécies de cianobactérias água doce mais relevantes (Tabela 1), utilizando o microarray de anticorpos CYANOCHIP. O microarray pode ser um formato de 3 x 8 microarray impressas em lâminas de microscópio. Cada micro-arranjo é feito de um conjunto de 17 anticorpos impressas num padrão de mancha triplicado, seus anticorpos pré-imunes correspondentes e BSA como controlos negativos. Os microarrays também incluir uma estrutura de fluorescência, utilizando um anticorpo pré-imune marcado por fluorescência para localizar facilmente o padrão de microarray 22 (Figura 1).
O microarray foi testado no campo para a análise in situ de amostras de água coletadas na costa da água doce Lozoya Reservoir, que abastece a cidade de Madrid. As amostras foram processadas tal como descrito acima, e oprincipais immunoreactions positivos foram de anticorpos para cianobactérias planctônicas, tais como Microcystis spp. (K4 e K5), e a bênticos Oscillatoriales, tais como Leptolyngbya spp. (K10 e K15). Sinais de fluorescência mais baixos foram obtidos a partir de Nostocales (K6 e K12, dois planctônicas Aphanizomenon spp.), Bêntico Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1) e planctônicas Microcystis flos-aquae sp. (K3). observações em microscópio óptico (não mostrados) mostrou uma comunidade de cianobactérias diversificada dentro detritos terrígena abundante da costa. Várias espécies de Anabaena dominado a comunidade, mas Microcystis spp. e Pseudanabaena spp. também estavam presentes.
Além disso, o microarray também foi validado através do ensaio, uma esteira microbiana cerca de 1.000 anos de idade seco recolhido na McMurdo Plataforma de gelo na Antártida para testar a presença de cianobactérias markers. A Figura 1 mostra, reações positivas altamente fluorescentes em anticorpos produzidos para bênticos cianobactérias isoladas de outras esteiras da Antártida, incluindo Anabaena sp. e Leptolyngbya spp. (K14 e K15, respectivamente). Imunorreacções adicionais positivas foram detectadas com anticorpos para cianobactérias planctônicas, como Microcystis spp. (K4 e K5), Aphanizomenon spp. (K6 e K12), e Planktothrix rubescens sp. (K17). Baixos sinais foram obtidos a partir de anticorpos para outras espécies bentônicas isolado em uma esteira da Antártida, incluindo Tolypothrix sp. (K16) e Anabaena sp. (K1). A microscopia óptica de fluorescência revelou a presença de células estruturalmente semelhantes a cianobactérias e as algas verdes (não mostrado). Não foram identificados cianobactérias filamentosas. No entanto, foram detectadas várias estruturas amorfas fluorescentes de cerca de 1 um de tamanho e fluorescência difusa copiosa, WHICH pode ser atribuída à presença de restos celulares (quebrado e células mortas) e substâncias poliméricas extracelulares (EPS), respectivamente. Por conseguinte, a análise bioquímica mostrou que o tapete consistiu em quantidades profusas de biopolímeros e restos celulares (matéria biológica complexa) que poderiam ser os alvos para os anticorpos no microarray.
Figura 1: rápida e confiável Multiplex Microarray imunoensaio para a detecção de cianobactérias. A) Esquema mostrando as principais etapas do FSMI para a análise de amostras multi-alvo com um CYANOCHIP. B) Esquema de um layout padrão de impressão (por triplicado) a recolha de anticorpo anti-cianobactérias: (0) BSA, albumina de soro bovino; (X), apenas tampão impressão; (1-17) cada um dos anticorpos, tal como na Tabela 1 no Blanco et ai. 2015 (K1 a K17). De P1 a P17, os anticorpos pré-imunes correspondentes, actuam como controlos. Os rectângulos amarelos correspondem a um gradiente de mancha fluorescente como uma referência de quadro. C e D) de imagem que mostra a parte superior de um 1000-year-old tapete microbiano seco a partir da imagem CYANOCHIP detectar cianobactérias nesta esteira, respectivamente McMurdo Ice Shelf (Antarctica) e. E) Vista panorâmica do Lozoya Reservoir mostrando águas transparentes e sem partículas verdes visíveis no momento da amostragem. Imagem microarranjo depois da análise in situ da amostra de água F) (modificado a partir de referência 22).
| código de Ab | Imunógeno (cepa) | Ordem | Habitat | | As condições de cultura | |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | desconhecido | BG11 e nitrato | 30 ºC, luz contínua |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | desconhecido | BG11o | 30 ºC, luz contínua |
| K3 | Microcystis flos-aquae | Chroococcales | planctônicas | BG11 | 28 ºC, luz contínua |
| K4 | novacekii Microcystis | Chroococcales | planctônicas | BG11 | 28 ºC, luz contínua |
| K5 | aeruginosa Microcystis | Chroococcales | planctônicas | BG11 | 28 ºC, luz contínua |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | planctônicas | BG11o | 28 ºC, luz contínua |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bentônica | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bentônica | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | bentônica | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K10 | Leptolyngbya Boryana | Oscillatoriales | bentônica | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K11 | distorta Tolypothrix | Nostocales | bentônica | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K12 | aphanizomenoides Aphanizomenon | Nostocales | planctônicas | BG11o | 28 ºC, luz contínua |
| K13 | Nostoc sp. (Antártica) | Nostocales | bentônica | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | bentônica | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bentônica | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bentônica | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperíodo |
| K17 | rubescens Planktothrix | Oscillatoriales | planktonic | Nenhum | Nenhum |
Tabela 1. Lista dos anticorpos (ABS) e as linhagens de cianobactérias usado para produzir o CYANOCHIP 22.
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Discussion
Aqui, um imunoensaio de sanduíche utilizando o multiplex fluorescente CYANOCHIP, uma micromatriz 17-anticorpo para a detecção e identificação de uma vasta gama de géneros de cianobactérias, é descrito 22. Estas cianobactérias representam os gêneros bentônicos e planctônicos mais frequente em habitats de água doce, alguns deles produtores de toxinas sendo. Recentemente, o formato de sanduíche imunoensaio fluorescente foi utilizado para identificar os microorganismos e / ou bioanalytes em aplicações de ambiente 26, 27, 28. O protocolo baseia-se principalmente em duas etapas: (i) imobilização ou anticorpos de captura para se ligar especificamente analitos a partir de uma amostra de teste e (ii) detectar os pares de analito-anticorpo, utilizando anticorpos marcados com fluorescência (anticorpos marcadoras ou detector). Uma vez que o ensaio em sanduíche requer pelo menos dois locais de ligação de anticorpo acessíveis (epítopos) no analito paraa reacção a ter lugar, qualquer sinal fluorescente positivo indica a presença de relativamente grandes e complexos multiméricos oligo- ou analitos que são idênticos ou altamente semelhantes aos utilizados para produzir os anticorpos de captura.
Mesmo que esse método requer pequenos volumes e preparação de base da amostra, sem a necessidade de experiência ou conhecimento especial, várias desvantagens poderia arruinar o ensaio. sinais de fluorescência baixos ou uma completa falta dela pode ser devido a purificação de anticorpos deficiente ou pobre eficiência de marcação. Para o isolamento da IgG de coelho, proteína A é a melhor escolha, uma vez que se liga especificamente com elevada eficiência com a região Fc de imunoglobulinas. Como indicado no ponto 4, devem ser utilizados anticorpos fluorescentes com um intervalo de rotulagem entre 3-7 mol de corante por mole do anticorpo. Além disso, uma falta de manchas fluorescentes pode ser explicada pela concentração de analitos encontram-se abaixo do limite de detecção. Neste caso, a amostra pode ser concentradoentrated antes da incubação com o micro-arranjo, ou quantidades maiores podem ser usadas para uma nova extracção. fundos fluorescentes elevados são o resultado de bloqueio de chip ineficiente e / ou etapas de lavagem e de extractos de amostras compostas de minerais e matéria orgânica complexa que furam no chip. Quando as amostras de complexos são usados como analitos, é desejável aumentar o seu sal e / ou a concentração de detergente para favorecer a interacção específica entre os pares de analito-anticorpo.
Nos últimos anos, a tecnologia de microarray de anticorpos tem sido desenvolvido para aplicações ambientais. No entanto, a utilização desta técnica implica algumas limitações. Os anticorpos policlonais são mais rápidos e mais barato de produzir e, mais importante ainda, a possibilidade de se ligar qualquer epitopo alvo numa amostra ambiental complexo são teoricamente maior do que com anticorpos monoclonais. No entanto, o fato de que eles podem reconhecer epítopos diferentes aumenta o número de reações cruzadas nos EFMI. Para obter uma elevada especificidade, a utilização de métodos de separar estes eventos de reactividade cruzada das verdadeiras reacções de antigénio-anticorpo cognatos utilizando métodos de desconvolução 26, 27, por exemplo, é altamente desejável. Basicamente, o micro-arranjo é considerado um biossensor qualitativo para a detecção múltipla e classificação de cianobactérias. A este respeito, é essencial para determinar o limite de detecção para cada um dos anticorpos um-a-um para utilizar as suas concentrações de trabalho óptima no ensaio. Embora este microarray, em conjunto com FSMI, não é concebido como um método quantitativo, o biossensor implica alta sensibilidade, porque o limite inferior de detecção de a maior parte dos anticorpos contidos no CYANOCHIP 22 é de 10 2 a 10 3 células / ml.
Apesar destas limitações, esta metodologia tem várias vantagens contra outras técnicas utilizadas na m ambientalONITORIZAÇÃO. Anticorpo de biossensores permitir a possibilidade de reconhecimento de moléculas diferentes ao mesmo tempo num único análise, a possibilidade de detectar baixas concentrações de analitos, e a possibilidade de produzir anticorpos contra praticamente qualquer substância. Além disso, o micro-arranjo pode atingir até 24 analisa num único ensaio, com limites de detecção de 10 2 células / ml. Em comparação com outros métodos, os anticorpos podem detectar células mortas da vida ou, material extracelular, e os restos celulares. Embora ele tenha pelo menos 4 horas para completar todo o ensaio, é mais rápido do que outros métodos analíticos aplicados à monitorização ambiental. O CYANOCHIP foi originalmente concebido para a identificação de linhagens de cianobactérias. Este biossensor não foi formalmente concebido para o efeito, para que ele possa identificar produtores de toxinas potenciais e poderia ser melhorada no futuro, adicionando anticorpos contra uma ampla gama de novas cepas. ensaios bioquímicos, tais como ELISA, PPIA e neuroquímicaTestes em ratos, permitir a identificação de cianotoxinas, mas eles estão restritos a algumas toxinas conhecidas e pode dar falsos positivos. Além disso, usando o CYANOCHIP não requer treinamento especial, enquanto microscopia e mouse bioensaios ópticos exigem pessoal treinado ou trabalho intensivo com animais vivos, e eles não dão informações sobre o tipo de toxinas presentes na amostra. Cianotoxinas também podem ser identificados e quantificados por outros métodos analíticos, tais como HPLC, GC-MS, ou MALDI-TOF. Nestes métodos, a amostra deve ser purificado, e a ausência de padrões de referência limita a identificação de cianotoxinas. Além disso, métodos analíticos exigem equipamento e material caro e treinamento especializado. Métodos moleculares são baseados na extração de DNA a partir de amostras, enquanto FSMI requer apenas um extrato ambiental elaborado em um par de passos muito simples, sem purificação cianobactérias.
O alto desempenho do CYANOCHIP paraa detecção in situ de cianobactérias em reservatórios de água doce torna uma nova ferramenta para o alerta em caso de administradores de água. Além disso, o micro-arranjo também é interessante para o campo de astrobiology, particularmente para a busca de marcadores microbianos como evidência de vida. O estudo dos extremófilos pode nos ajudar a entender a origem da vida na Terra e como a vida poderia sobreviver em ambientes extremos presentes em nosso sistema solar e além. Como vários ambientes da Terra são muito semelhantes aos lugares em outros planetas, como Marte, talvez seja possível encontrar restos de procariontes fotossintéticos como evidências de vida extintas. O microarray foi capaz de identificar marcadores de cianobactérias de viver ou células não vivos; de população permanece e / ou material extracelular em tapetes microbianos de idade (Figura 1); e da água, solo e rochas coletadas em ambientes extremos, como a Antártica, Atacama, os lagos andinos, o Alto Árctico, ou oRio Tinto área em Espanha (não mostrado). Considerando-se que as cianobactérias são microorganismos primitivos da Terra, não há razão para acreditar que eles poderiam uma vez ter vivido em outros planetas.
Em conclusão, o fato de que CYANOCHIP-FSMI pode identificar nos marcadores de cianobactérias in situ e pode até mesmo associá-los a diferentes filotipos ou grupos, e que o microarray abrange uma ampla gama de habitats, incluindo os de plâncton, bentos e endoliths, demonstra que este técnica poderia uma ferramenta para monitoramento ambiental. Futuras melhorias para o micro-arranjo pode ser o de aumentar o número de anticorpos de novas estirpes de modo a que os grupos pendentes correspondentes filogenéticos são incluídos. Além disso, o chip pode ser implementado com anticorpos para compostos de cianobactérias específicos, tais como toxinas ou polímero cyanophicin. Isto é especialmente relevante para o monitoramento de reservatórios de água doce, canos e instalações em instalações humanos. O micr atualoarray e as versões futuras serão muito úteis no campo da astrobiologia, quer para a detecção de vida ou do controlo das instalações espaciais humanos (por exemplo, monitoramento de reservatórios de água ou sistemas de suporte de vida). Na verdade, nós rotineiramente usar o microarray em campanhas de campo para ambientes extremos, como um método para a detecção "in loco" da vida permanece. O microarray é parte do chamado Detector Chip Vida (LDChip), um microarray com mais de 300 anticorpos para a busca de vida em missões de exploração planetária 29, 30. O microarray sozinho ou como parte do LDChip será implementado nas Signs of Life Detector (SOLID) instrumento 29 para validar o conceito SOLID-LDChip para a exploração planetária em várias campanhas de campo a análogos terrestres. O microarray irá fornecer informações úteis através da identificação de cianobactérias e / ou suas toxinas. Ao determinar as estirpes, ele irá give informações sobre os ambientes e os habitats em que se desenvolveram.
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Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Antonio Quesada pela Universidad Autónoma de Madrid para fornecer linhagens de cianobactérias. Este trabalho foi financiado pela Subdirección Geral de Proyectos de Investigación do Espanhol Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), não concede nenhum. AYA2011-24803 e ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
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