Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture
Summary
Cet article décrit le protocole pour la culture de neurones hippocampiques primaires de basse densité en croissance sur des lamelles de verre inversées sur une monocouche de cellules gliales. Les couches de neurones et de cellules gliales sont séparés par des billes de cire de paraffine. Les neurones cultivés par ce procédé sont appropriés pour l'imagerie optique à haute résolution et des essais fonctionnels.
Abstract
La capacité à sonder la structure et de la physiologie des cellules nerveuses individuelles dans la culture est essentielle pour l'étude de la neurobiologie, et permet une certaine souplesse dans la manipulation génétique et chimique des cellules individuelles ou des réseaux définis. Une telle facilité de manipulation est plus simple dans le système de culture réduite par rapport au tissu cérébral intact. Bien que de nombreuses méthodes pour l'isolement et la croissance de ces neurones primaires existent, chacun a ses propres limites. Ce protocole décrit un procédé de culture de faible densité et de haute pureté rongeurs embryonnaires neurones hippocampiques sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales. Cette « culture sandwich » permet une croissance exclusive à long terme d'une population de neurones tout en permettant un soutien trophique de la monocouche gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont suffisamment âgé ou au niveau de la maturité, les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l'imagerie ou des analyses fonctionnelles. g neuronesrown par cette méthode survivent généralement pendant plusieurs semaines et développer de vastes tonnelles, les connexions synaptiques et les propriétés du réseau.
Introduction
Le cerveau est organisé en réseaux complexes de neurones. La contribution des neurones individuels à l'activité du réseau et la fonction cérébrale peut être étudiée par une altération sélective de leur composition moléculaire et perturbance de leurs propriétés physiologiques. La manipulation génétique et chimique des neurones individuels est sans doute plus facile dans les neurones en culture que dans le tissu cérébral intact, non grevé par l'hétérogénéité et la complexité cellulaire de ce dernier. Neurones dans la culture se développent axonale bien définis et arborisation dendritique et forment de vastes connexions synaptiques entre eux.
Alors que la culture des neurones des animaux adultes ou d'autres régions du système nerveux est possible, les cultures hippocampiques embryonnaires sont souvent préférées en raison de leur population cellulaire pyramidale définie et relativement faible densité gliale 1, 2. neurones hippocampiques cultivés à faible densité dans la culture sont particulièrement ammenable à l'étude de la localisation subcellulaire, le trafic des protéines, la polarité neuronale et le développement des synapses. Les neurones de culture ont également été largement utilisé dans l' étude des processus moléculaires dans la plasticité synaptique 3, 4, 5, 6. Préparations de culture Neuron de souris avec des délétions génétiques globales qui ne survivent pas postnatal ont été particulièrement utiles dans l' étude des rôles cellulaires et synaptiques de certains gènes 7.
Comme dans le cerveau, les neurones hippocampiques en culture dépendent du soutien des cellules gliales trophique. Cela complique leur culture, et a conduit au développement de plusieurs méthodes différentes par lesquelles ce soutien est fourni. Une méthode couramment utilisée consiste à plaquer directement les neurones sur une monocouche de cellules gliales 8, ou qui permettent à des cellules gliales contaminant du hipp acquisocampal tissu à proliférer et à former une monocouche sous les neurones 9. Bien que cette méthode a trouvé un certain succès, l'impureté de la culture neuronale résultante est désavantageux pour des expériences d'imagerie. Une autre méthode couramment utilisée pour la culture de neurones est de laisser-out de la couche d' alimentation de cellules gliales au total, et au lieu de fournir un support trophique sous la forme d'un milieu de croissance défini 10.
Nous décrivons ici la méthode « sandwich » ou « Banker » de la culture des neurones 2, 11. Cette méthode consiste à plaquer les neurones de l'hippocampe sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales séparées par des perles de cire de paraffine. Cela facilite la culture à long terme d'une population homogène de neurones sans contaminer glie tout en permettant le soutien de la monocouche trophique gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont de niveau suffisant âge ou de maturité,les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l'imagerie ou des analyses fonctionnelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que la méthode « sandwich » de la culture des neurones a été bien décrit par ailleurs 2, 11, il y a plusieurs étapes dans le protocole qui sont assez difficiles à décrire seul dans le texte, ce qui peut conduire à la frustration pour les chercheurs qui souhaitent adopter.
La méthode peut être divisée en trois grands flux de travail: culture gliales, préparation de la culture et de couvre-neurone et de maintenance. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les IRSC RdP-142209 à TJS.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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