A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron
Summary
Questo articolo descrive il protocollo per la coltura a bassa densità primari neuroni ippocampali crescono su vetrini invertiti su un monostrato gliale. Gli strati neuroni e gliali sono separati da perline di cera di paraffina. I neuroni coltivati con tale metodo adatto per imaging ottico ad alta risoluzione e saggi funzionali.
Abstract
La capacità di sondare la struttura e la fisiologia delle singole cellule nervose in coltura è fondamentale per lo studio della neurobiologia, e consente flessibilità nella manipolazione genetica e chimica delle singole cellule o reti definite. Tale facilità di manipolazione è semplice nel sistema di coltura ridotta rispetto al tessuto cerebrale intatto. Mentre esistono molti metodi per l'isolamento e la crescita di questi neuroni primari, ognuno ha i suoi limiti. Questo protocollo descrive un metodo per la coltura a bassa densità ed elevata purezza roditori embrionali neuroni dell'ippocampo su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali. Questo 'coltura a sandwich' consente esclusiva crescita a lungo termine di una popolazione di neuroni pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficienti o livello di maturità, i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell'imaging o saggi funzionali. neuroni grown con questo metodo tipicamente sopravvivere per diverse settimane e sviluppare ampie pergole, connessioni sinaptiche, e le proprietà di rete.
Introduction
Il cervello è organizzato in reti complesse di neuroni. Il contributo dei singoli neuroni per attività di rete e la funzione cerebrale può essere studiato alterazione selettiva della loro composizione molecolare e perturbazione delle loro proprietà fisiologiche. Genetica e chimica manipolazione di singoli neuroni è senza dubbio più facile nei neuroni in coltura che in tessuto cerebrale intatto, libera da eterogeneità cellulare di quest'ultimo e la complessità. Neuroni in coltura sviluppano assonale ben definita e arbors dendritiche e formano estese connessioni sinaptiche con l'altro.
Mentre la cultura neurone da animali adulti o da altre regioni del sistema nervoso è possibile, colture ippocampali embrionali sono spesso preferiti a causa della loro popolazione cellulare piramidale definita e densità relativamente bassa gliale 1, 2. neuroni dell'ippocampo coltivati a bassa densità in coltura sono particolarmente amenable allo studio della localizzazione subcellulare, il traffico di proteine, di polarità neuronale e lo sviluppo delle sinapsi. Neuroni in coltura sono anche stati ampiamente impiegati in studio dei processi molecolari nella plasticità sinaptica 3, 4, 5, 6. Preparati cultura Neuron da topi con delezioni genetiche globali che non sopravvivono dopo la nascita sono stati particolarmente utili nello studio ruoli cellulari e sinaptici di alcuni geni 7.
Come nel cervello, in coltura neuroni dell'ippocampo sono dipendente dal sostegno trofico dalle cellule gliali. Questo complica la loro cultura, e ha portato allo sviluppo di diversi metodi con cui questo supporto è fornita. Un metodo comunemente usato comporta placcatura neuroni direttamente su un monostrato di cellule gliali 8, o che consentono cellule gliali contaminanti dal hipp acquisitatessuto ocampal a proliferare e formare un monostrato sotto i neuroni 9. Mentre questo metodo ha trovato un certo successo, l'impurità della cultura neuronale risultante è svantaggioso per esperimenti di imaging. Un altro metodo comunemente usato di cultura neurone è lasciare-out l'alimentatore gliali strato del tutto, e invece fornire supporto trofico nella forma di un mezzo di crescita definito 10.
Qui, descriviamo il "sandwich" o il metodo "Banker" della cultura neurone 2, 11. Questo metodo comporta placcatura neuroni ippocampali su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali separate da perline di cera di paraffina. Questo facilita coltura a lungo termine di una popolazione omogenea di neuroni senza contaminare glia pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficiente o livello di maturità,i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell'imaging o saggi funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre il metodo "sandwich" di neuroni in coltura è stata ben descritta-altrove 2, 11, ci sono diversi passaggi in tutto il protocollo che sono molto difficili da descrivere in solo testo, che può portare alla frustrazione per gli investigatori che vogliono adottarlo.
Il metodo può essere suddiviso in tre grandi flussi di lavoro: cultura gliali, preparazione coprioggetto e cultura neurone e manutenzione. Ognuno dei tre p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da CIHR MOP-142.209 a TJS.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
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