Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Polyploidie wurde in spezialisierten Geweben von Säugetieren nicht nur beobachtet, sondern auch in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie Krebs und degenerativen Erkrankungen. Polyploiden (meist tetraploid) Zellen werden oft in präneoplastischen Läsionen des menschlichen Geweben beobachtet, wie Barrett-Ösophagus 1,2 oder Plattenepithelkarzinom intraepitheliale Läsionen des Gebärmutterhalses 3,4, und wurden als die Quelle für maligne aneuploid Zellen in diesen Geweben auf 5 , 6. Obwohl vorgeschlagen wird, dass zur Aneuploidzellen Umwandlung von tetraploiden ein entscheidendes Ereignis in den frühen Stadien der Tumorgenese sein könnte, die an diesem Prozess beteiligten Mechanismen sind nicht vollständig verstanden. Dies ist zum Teil , weil keine in – vitro – Modell verfügbar ist , wo nicht – transformierten polyploid menschlichen Zellen ausbreiten kann.
Einige Forscher haben induzierte Tetraploidie in nicht-transformierten menschlichen Epithelzellen durch Erzeugung von zweikerniger Zellen durch Einwibiting cytokinesis 7-9. In diesem Verfahren muß jedoch unnötige diploiden Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) eliminiert werden 7,8 oder Klonierung durch limitierende Verdünnung 9. Da diese Verfahren mühsam und nicht leicht durchzuführen sind, einfacherer Methoden nicht transformierten tetraploiden Zellen zu etablieren sind für die Forschung auf diesem Gebiet erwünscht.
Im vorliegenden Bericht beschreiben wir ein Protokoll proliferative tetraploiden Zellen von normalen humanen Fibroblasten oder Telomerase-immortalisierten humanen Fibroblasten durch relativ einfache Verfahren zu etablieren. Die Verfahren verwenden Spindelgift Demecolcin (DC) diploiden Zellen in der Mitose und mitotischen Zellen durch Abschütteln gesammelt zu verhaften werden weiter mit DC behandelt. Diploide mitotischen mit DC behandelten Zellen für eine längere Zeit zu tetraploiden G1 Zellen umwandeln, und diese Zellen vermehren als tetraploiden Zellen nach Wachstumsstopp für mehrere Tage nach der Arzneimittelentfernung. Dieses Protokoll siehtein effizientes Verfahren ein nützliches Modell für die Erstellung der Beziehung zwischen Chromosom Instabilität und dem onkogenen Potential der polyploiden menschlichen Zellen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Hauptproblem bei der Induktion von Tetraploidie von diploiden Zellen, die durch chemische Mittel, entweder durch Zytokinese Inhibitoren oder durch Spindelinhibitoren, ist, dass die Zellen häufig eine Mischung aus diploide und tetraploide Populationen werden und tetraploiden Zellen müssen von diploiden Zellen getrennt werden. Die häufigsten Ansätze zur Isolierung einer tetraploiden Bevölkerung verwenden frei von diploiden Zellen FACS oder Klonierung durch limitierende Verdünnung. Jedoch sind diese Verfahren mü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
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