הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Polyploidy נצפתה לא רק ברקמות מקצועיות של מינים יונקים אלא גם במגוון של מצבים פתולוגיים, כגון סרטן ומחלות ניווניות. תאים polyploid (בעיקר tetraploid) הם נצפו לעתים קרובות בנגעים preneoplastic של רקמות אנושיות, כגון נגעים intraepithelial 1,2 או קשקש ושט בארט של 3,4 צוואר הרחם, ואת כבר נחשב כמקור לתאי aneuploid ממאיר ברקמות אלו 5 , 6. למרות זאת הוא הציע מרה של tetraploid לתאי aneuploid יכולה להיות אירוע מכריע בשלבים המוקדמים של tumorigenesis, המנגנונים המעורבים בתהליך זה אינם מובנים במלואם. זה גם בגלל שאין מודל במבחנה כבר זמין שבו תאים אנושיים polyploid nontransformed יכול להפיץ.
ישנם חוקרי מושרה tetraploidy בתאי אפיתל אדם nontransformed באמצעות דור של תאי binucleated ידי Inhibiting cytokinesis 7-9. בשיטה זו, לעומת זאת, תאים דיפלואידי מיותר חייבים להתבטל על ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) 7,8 או שיבוט על ידי הגבלת דילול 9. בגלל הליכים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע, שיטות פשוטות יותר להקים תאי tetraploid nontransformed הם רצויים עבור מחקר בתחום זה.
בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול להקים תאי tetraploid שגשוג מן fibroblasts אדם נורמלי או פיברובלסטים אדם הנציח טלומרז ידי נהלים פשוטים יחסית. הנהלים להשתמש demecolcine רעל כישור (DC) לעצור תאי דיפלואידי ב מיטוזה, ותאי mitotic שנאספו על ידי מנערים מטופלים נוספים עם DC. תאי mitotic דיפלואידי שטופלו DC עבור זמן ממושך להמיר תאי G1 tetraploid, ותאים אלה להתרבות תאי tetraploid כמו לאחר מעצרו צמיחה במשך כמה ימים לאחר הסרת תרופה. פרוטוקול זה מספקשיטה יעילה ליצירת מודל שימושי כדי לחקור את הקשר בין אי יציבות כרומוזום והפוטנציאל בשעור של תאים אנושיים polyploid.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחת הבעיות העיקריות אינדוקציה של tetraploidy מתאי דיפלואידי ידי חומרים כימיים, בין אם על ידי מעכבי cytokinesis או על ידי מעכבי ציר, הוא שתאי הופכים לרוב תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid, ותאי tetraploid יש להפריד בין תאי דיפלואידי. רוב הגישות הנפוצות לבידוד תרמי של אוכלוסייה tetra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett’s esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
