Nontransformed मानव fibroblasts से Proliferative टेट्राप्लोइड प्रकोष्ठों की स्थापना
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Polyploidy स्तनधारी प्रजातियों के विशेष ऊतकों में भी, लेकिन इस तरह के कैंसर और अपक्षयी रोगों के रूप में रोग की स्थिति की एक किस्म में ही नहीं देखा गया है। Polyploid (ज्यादातर टेट्राप्लोइड) कोशिकाओं अक्सर ऐसे बैरेट घेघा 1,2 या स्क्वैमस गर्भाशय ग्रीवा 3,4 के अंतःउपकला घावों के रूप में मानव ऊतकों के preneoplastic घावों में मनाया जाता है, और उन ऊतकों 5 में घातक aneuploid कोशिकाओं का स्रोत माना गया है , 6। हालांकि यह सुझाव दिया है कि aneuploid कोशिकाओं को टेट्राप्लोइड के रूपांतरण tumorigenesis के प्रारंभिक दौर में एक महत्वपूर्ण घटना हो सकती है, इस प्रक्रिया में शामिल तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। यह आंशिक रूप क्योंकि कोई इन विट्रो मॉडल उपलब्ध किया गया है, जहां nontransformed polyploid मानव कोशिकाओं का प्रचार कर सकते हैं।
कुछ शोधकर्ताओं द्वारा INH binucleated कोशिकाओं की पीढ़ी के माध्यम से nontransformed मानव उपकला कोशिकाओं में tetraploidy प्रेरित किया हैcytokinesis 7-9 ibiting। इस विधि में, हालांकि, अनावश्यक द्विगुणित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा समाप्त किया जाना चाहिए 7.8 या कमजोर पड़ने 9 सीमित द्वारा क्लोनिंग। क्योंकि इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने और श्रमसाध्य आसान नहीं हैं, सरल तरीकों की स्थापना के लिए nontransformed टेट्राप्लोइड कोशिकाओं को इस क्षेत्र में अनुसंधान के लिए वांछित हैं।
वर्तमान रिपोर्ट में, हम अपेक्षाकृत सरल प्रक्रियाओं द्वारा सामान्य मानव fibroblasts या टेलोमिरेज-अमर मानव fibroblasts से proliferative टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रक्रियाओं धुरी जहर demecolcine (डीसी) का उपयोग बँटवारा में द्विगुणित कोशिकाओं, और mitotic कोशिकाओं बंद मिलाते हुए आगे डीसी के साथ व्यवहार कर रहे हैं द्वारा एकत्र की गिरफ्तारी के लिए। द्विगुणित mitotic कोशिकाओं लंबे समय के लिए डीसी के साथ इलाज किया टेट्राप्लोइड G1 कोशिकाओं को बदलने, और इन कोशिकाओं को दवा हटाने के बाद कई दिनों के लिए विकास के रूप में गिरफ्तारी के बाद टेट्राप्लोइड कोशिकाओं पैदा करना। इस प्रोटोकॉल प्रदान करता हैगुणसूत्र अस्थिरता और polyploid मानव कोशिकाओं की ऑन्कोजेनिक क्षमता के बीच संबंध का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाने के लिए एक कारगर तरीका।
Protocol
Representative Results
Discussion
, या तो cytokinesis अवरोधकों से या धुरी अवरोधकों द्वारा रासायनिक एजेंटों द्वारा द्विगुणित कोशिकाओं से tetraploidy की प्रेरण में एक प्रमुख समस्या यह है कि कोशिकाओं को अक्सर द्विगुणित और टेट्राप्लोइड आबादी का एक मिश?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett’s esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
