単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
単層カーボンナノチューブ（SWNT）は、アトミックの炭素原子の薄い層は、固有の電子的及び光学的特性を示す細長い円筒に巻かれています。 1このような特性は、その地域の環境に非常に敏感である励起子再結合を介して、近赤外（NIR）蛍光発光を生成するバンドギャップが含まれます。 SWNTのNIR放射は、光の侵入深さは、生物学的組織のために最大である近赤外窓内に入ります。 2,3また、SWNTは、有機蛍光色素分子とは対照的に、非定型のいくつかのユニークな特徴を示す：SWNTの展示大きなストークスシフト、退色しない、と点滅しません。 4最近、これらの特性を活用することは生物学への応用を有する新規分子センサーの品揃えの発展につながっています。 5,6未修飾は、しかしながら、SWNTは、水に不溶性であり、そして個々のSWNTの懸濁液を得ることが課題であることができます。 7,8 BundliNGの溶液中の単層カーボンナノチューブの集合体は、感知用途には適さない、それらをレンダリングそれらのバンドギャップ蛍光、2を難読化することができます。
水溶液中での個々のカーボンナノチューブを分散させて疎水性主導凝集を防止するために、それらの表面を修飾する必要があります。共有結合修飾は、単層カーボンナノチューブを、水溶性、10レンダリングならびに特定の結合化学を付与することができるが9、SWNT格子の欠陥サイトが減少またはそれらの蛍光発光を和らげます。疎水性およびπ-πスタッキング相互作用を介してナノチューブ表面に吸着13 –代わりに、SWNTの官能化は、界面活性剤、脂質、ポリマー及びDNA 9,11を使用することによって達成することができます。表面官能性SWNTの周囲の結果として生じる化学的環境は、そのコロナ相と呼ばれます。コロナ相の摂動はSWNTフッ素に変調を引き起こし、ナノチューブ表面上を移動する励起子に大きな影響を持つことができescence排出。これは、SWNTの大きな表面積に特異的な結合様式を組み込むことにより、新たな分子センサーの開発に利用することができるコロナ相とSWNTの蛍光との間のこの敏感な関係です。検体を結合するとSWNTコロナ相の摂動は、局所誘電環境の変化につながる電荷移動、またはシグナル伝達機構として機能するSWNTの蛍光放出を調節することができるすべてが格子欠陥を導入することができます。 14このアプローチは、DNA、15,16グルコース17ならびにATP、18の反応性酸素種19および窒素酸化物などの小分子を含む分子の多くの異なるクラスの検出のための新規蛍光センサーの開発に使用されます。 20,21しかし、これらのアプローチは、それらが標的分析物のための既知の結合様式の存在に依存しているという点で制限されています。
最近では、より一般的なアプリ蛍光センサーを設計するゴキブリは非共有結合性の両親媒性ヘテロ、リン脂質、およびポリ核酸で官能単層カーボンナノチューブを使用して開発されました。具体的には、タンパク質26,27または神経伝達物質のドーパミンを含む小分子を結合することができるユニークなコロナ相25 –これらの分子は、個々の単層カーボンナノチューブ22の非常に安定な懸濁液を生成するために、カーボンナノチューブの表面に吸着します。 28から30エンジニアリングのSWNTと特異的に結合する標的分析物を分散させるコロナ相としてコロナ相分子認識（CoPhMoRe）と呼ばれます。 28小型、低毒性、高い安定性とCoPhMoRe SWNTセンサーのunbleaching NIR蛍光はそれらに延長時間分解測定のための生体内検知のための優秀な候補となっています。 6最近の研究は、反応性窒素および酸素種の光学的検出のための植物組織における自分のアプリケーションを示しています。 31CoPhMoRe SWNTセンサーにとって特に刺激的な用途は、電気化学センシングまたは免疫組織化学などの他の技術は、空間分解能、時間分解能、および特異性の欠如に苦しんでいるような、生体内でドーパミンなどの神経伝達物質のラベルフリーの検出、の可能性です。
設計とCoPhMoRe SWNTセンサーを発見は、これまで特定のターゲットのためのセンサを発見する可能性を制限し、分散剤ライブラリーのサイズおよび化学的多様性によって拘束されています。現在までに、研究者は、唯一のSWNTセンサーのためのような機能的に活性な分散剤を提供することができ利用できる共役、共同ブロック、生物学的および生体模倣ポリマーの表面に傷しています。ここでは、両方の単層カーボンナノチューブを分散させ、高スループットスクリーニングのための単一のSWNTセンサー分析のためのそれらの蛍光を特徴付けるための別の方法を提示します。具体的には、ポリ核酸oligomとコーティングのSWNTのための手順を概説します者透析により界面活性剤交換により両親媒性ポリマーとSWNTを官能する方法だけでなく、直接超音波処理を使用して。私たちは、例として、ローダミンイソチオシアネート（RITC-PEG-RITC）で官能（GT）15 -DNAおよびポリエチレングリコールを使用しています。私たちは、ドーパミンの検出のためのCoPhMoReセンサとして（GT）15 -DNA SWNTの使用を示します。最後に、我々は、特性評価または単一分子検出のために使用することができる単一分子センサーの測定を行うための手順の概要を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
得られたSWNTポリマーハイブリッドのコロイド分散系によって提供される光学密度の増加によって示されるように、単層カーボンナノチューブを容易に、SDS又は一本鎖DNAとの直接的な超音波処理を介して、水溶液中に懸濁されます。 SDSおよびssDNAが分散し、疎水性またはπ-π相互作用を介してSWNT表面上に吸着させることによってSWNTのバンドルを可溶化します。さらに、ゲノムDNA、両親媒性ポ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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