Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
Einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) sind atomar dünne Schichten aus Kohlenstoffatomen rollten in lange, dünne Zylinder, die einzigartige elektronische und optische Eigenschaften aufweisen. 1 Derartige Eigenschaften umfassen eine Bandlücken Herstellung nahen Infrarot (NIR) Fluoreszenzemission über Exziton Rekombination , die sehr empfindlich gegenüber ihrer lokalen Umgebung ist. NIR- Emission von SWNTs fällt in den nahen Infrarot-Fenster, in dem die Eindringtiefe des Lichts für biologisches Gewebe maximal ist. 2,3 Zusätzlich zeigen SWNT einige einzigartige Eigenschaften atypisch im Gegensatz zu organischen Fluorophore: SWNT weisen eine große Stokes – Verschiebung, nicht photobleach, und nicht blinken. 4 In jüngster diese Eigenschaften ausnutzt , hat zur Entwicklung einer Zusammenstellung der neuen molekularen Sensoren mit Anwendungen in der Biologie geführt. 5,6 Unveränderte sind jedoch SWNTs in Wasser unlöslich und Suspensionen einzelner SWNT zu erhalten , kann eine Herausforderung sein. 7,8 Bundling und Aggregation von einwandigen Nanoröhren in Lösung können ihre Bandlückenfluoreszenz, 2 macht sie ungeeignet für Sensoranwendungen zu verschleiern.
Dispergier- einzelnen Kohlenstoff-Nanoröhren in wässriger Lösung erfordert ihre oberflächenmodifizierenden Hydrophobizität getriebenen Aggregation zu verhindern. 9 Während Modifikation kovalente kann SWNT wasserlöslich machen, 10 sowie vermitteln spezifische Bindungschemie, Defektstellen im SWNT Gitter reduzieren oder ihre Fluoreszenzemission abklingen. 13 , die durch hydrophobe und pi-pi Stapel – Wechselwirkungen an die Nanoröhrenoberfläche adsorbieren – Stattdessen kann SWNT Funktionalisierung unter Verwendung von Tensiden, Lipiden, Polymeren und DNA 9,11 erreicht werden. Die sich ergebende chemische Umgebung umgebende Oberfläche funktionalisierte SWNTs wird als seine corona Phase. Störeinflüsse auf die Corona-Phase kann einen großen Einfluss auf Exzitonen haben auf der Oberfläche von Nanoröhren reisen, Modulationen verursacht fluor zu SWNTescence Emission. Es ist dieses empfindliche Beziehung zwischen der Koronaphase und SWNT Fluoreszenz, die durch den Einbau von spezifischen Bindungsmodalitäten auf die große Oberfläche von SWNT neuen molekularen Sensoren zu entwickeln, ausgenutzt werden kann. Störeinflüsse auf die SWNT Corona Phase bei Analyt-Bindung kann in der lokalen dielektrischen Umgebung zu Veränderungen führen, Ladungstransfer oder Gitterfehler einführen, die alle die Fluoreszenzemission der SWNTs modulieren kann als Signalübertragungsmechanismus zu dienen. 14 Dieser Ansatz in der Entwicklung neuer Fluoreszenzsensoren für den Nachweis von vielen verschiedenen Klassen von Molekülen , einschließlich DNA, 15,16 Glucose 17 und kleine Moleküle, wie ATP, 18 reaktive Sauerstoffspezies 19 und Stickstoffmonoxid verwendet wird. 20,21 Jedoch sind diese Ansätze beschränkt, daß sie sich auf die Existenz eines bekannten Bindungs Modalität für die Zielanalyten verlassen.
Vor kurzem wurde eine allgemeinere AppRotauge Fluoreszenzsensoren zur Gestaltung wurde SWNTs nicht-kovalent funktionalisiert mit amphiphilen Hetero, Phospholipide und Polynucleinsäuren entwickelt wurden. Diese Moleküle adsorbieren an Kohlenstoff – Nanoröhrchen – Oberflächen zu produzieren hochstabile Suspensionen einzelner SWNT 22-25 mit einzigartigen Corona – Phasen , die spezifisch Proteine 26,27 oder kleine Moleküle einschließlich des Neurotransmitters Dopamin binden kann. 28-30 Engineering the Corona Phase SWNTs und spezifisch binden Zielanalyten zu dispergieren , wird als Corona – Phase molekulare Erkennung (CoPhMoRe) bezeichnet. 28 Die kleine Größe, geringe Toxizität, hohe Stabilität und unbleaching nIR Fluoreszenz von CoPhMoRe SWNT – Sensoren machen sie zu ausgezeichneten Kandidaten für die in vivo Mess für längere zeitaufgelöste Messungen. 6 Neuere Arbeiten zur optischen Detektion von reaktivem Stickstoff und Sauerstoff – Spezies ihre Anwendungen in Pflanzengewebe gezeigt. 31Eine besonders spannende Anwendung für CoPhMoRe SWNT – Sensoren ist das Potenzial für markierungsfreie Detektion von Neurotransmittern wie Dopamin in vivo, wo andere Techniken, wie elektrochemische Mess oder Immunhistochemie, leiden an einem Mangel an räumlicher Auflösung, zeitliche Auflösung und Spezifität.
Die Projektierung und die Entdeckung CoPhMoRe SWNT-Sensoren hat bisher von der Größe und chemische Vielfalt der Dispersions Bibliothek zurückgehalten worden, um die Wahrscheinlichkeit zu begrenzen eines Sensors für ein bestimmtes Ziel zu finden. Bisher haben Forscher verkratzt nur die Oberfläche der verfügbaren konjugierten, co-block, biologische und biomimetische Polymere, die als funktionell aktives Dispergiermittel für SWNT-Sensoren dienen. Hier stellen wir verschiedene Methoden für beide SWNT Dispergieren und ihre Fluoreszenz für Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung für einzelne SWNT-Sensor-Analyse. Insbesondere beschreiben wir das Verfahren zur Beschichtung von SWNT mit Polynukleinsäure oligomers durch direkte Beschallung sowie wie SWNT mit amphiphilen Polymeren durch Tensid Austausch durch Dialyse zu funktionalisieren. Wir verwenden (GT) 15 -DNA und Polyethylenglykol funktionalisiert mit Rhodaminisothiocyanat (RITC-PEG-RITC) als Beispiele. Wir veranschaulichen die Verwendung von (GT) 15 -DNA SWNTs als CoPhMoRe Sensor für den Nachweis von Dopamin. Schließlich beschreiben wir Verfahren zur Einzelmolekül-Sensormessungen durchführt, die für die Charakterisierung oder Einzelmolekülmessung verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
SWNTs werden in wässriger Lösung durch direkte Beschallung mit SDS oder ssDNA leicht suspendiert, wie durch eine Zunahme der optischen Dichte durch die kolloidale Dispersion des resultierenden SWNT-Polymer-Hybrid vorgesehen angegeben. SDS und ssDNA streut und solubilisiert Bündel von einwandigen Nanoröhren durch durch hydrophobe oder pi-pi-Wechselwirkungen auf die SWNT Oberfläche zu adsorbieren. Zusätzlich können andere Polymere, wie genomische DNA, amphiphile Polymere, konjugierte Polymere und Lipiden, auf die O…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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