Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
-walled nanotubos de carbono (nanotubos de carbono) são atomicamente finas camadas de átomos de carbono enroladas em cilindros longos e finos que apresentam propriedades eletrônicas e ópticas únicas. 1 Essas propriedades incluem uma band-gap produção de infravermelho próximo (NIR) de emissão de fluorescência através de recombinação éxciton que é altamente sensível ao seu ambiente local. A emissão de NIR de nanotubos de carbono cai dentro da janela de infravermelho próximo, em que a profundidade de penetração da luz é máxima para o tecido biológico. 2,3 Além disso, nanotubos de carbono exibem várias características únicas atípicas em contraste com fluoróforos orgânicos: SWNT exibem um grande deslocamento de Stokes, não photobleach, e não piscar. 4 Recentemente, explorando estas características tem levado ao desenvolvimento de uma variedade de sensores moleculares novos com aplicações em biologia. 5,6 não modificado, no entanto, nanotubos de carbono são insolúveis em água, e a obtenção de suspensões de nanotubos individuais pode ser um desafio. 7,8 Bundling e agregação de SWNTs em solução pode ofuscar sua fluorescência band-gap, 2 tornando-os inadequados para aplicações de detecção.
Dispersar os nanotubos de carbono individuais em solução aquosa requer modificando sua superfície para evitar a agregação orientado a hidrofobia. 9 Enquanto modificação covalente pode tornar nanotubos de carbono solúvel em água, 10, bem como conferir a química de ligação específica, os locais de defeitos na estrutura SWNT reduzir ou diminuir a sua emissão de fluorescência. Em vez disso, SWNT funcionalização pode ser realizado usando agentes tensioactivos, lípidos, polímeros e ADN de 9,11 – 13, que adsorvem a superfície do nanotubo através de interacções hidrofóbicas e de empilhamento pi-pi. O ambiente circundante química resultante nanotubos de carbono funcionalizado de superfície é referido como a sua fase de corona. Perturbações para a fase de corona pode ter um grande impacto sobre excitons que viajam na superfície do nanotubo, fazendo com modulações de SWNT fluorescence emissões. É esta relação sensível entre a fase de corona e de fluorescência SWNT que podem ser exploradas para desenvolver novos sensores moleculares através da incorporação de modalidades de ligação específicos para a área de superfície grande da SWNT. Perturbações para a fase de corona SWNT sobre analito de ligação pode conduzir a alterações no ambiente dieléctrico local, transferência de carga, ou introduzir defeitos de rede, todos os quais podem modular a emissão de fluorescência dos nanotubos de carbono para servir como um mecanismo de transdução de sinal. 14 Esta abordagem é utilizada no desenvolvimento de novos sensores fluorescentes para a detecção de muitas classes diferentes de moléculas de ADN, incluindo, glicose 15,16 e 17 de pequenas moléculas, tais como ATP, 18 espécies de oxigénio reactivas e 19 óxido nítrico. 20,21 No entanto, estas abordagens estão limitadas na medida em que dependem da existência de uma modalidade de ligação conhecida para o analito alvo.
Recentemente, um app mais genéricobarata para a concepção de sensores fluorescentes foi desenvolvido usando nanotubos de carbono não-covalentemente funcionalizados com heteropolímeros anfifílicos, fosfolípidos e ácidos polinucleicos. Estas moléculas de adsorver a superfícies de nanotubos de carbono para produzir suspensões altamente estáveis de SWNTs individuais 22 – 25 com fases corona únicas que podem se ligam especificamente proteínas 26,27 ou pequenas moléculas, incluindo o neurotransmissor dopamina. 28-30 Engenharia da fase de corona para dispersar SWNTs e especificamente analitos alvo de ligação é referido reconhecimento molecular de fase como corona (CoPhMoRe). 28 O tamanho pequeno, baixa toxicidade, alta estabilidade e unbleaching fluorescência NIR de sensores CoPhMoRe SWNT torná-los excelentes candidatos para detecção in vivo para medições resolvidas no tempo prolongados. 6 trabalho recente mostrou suas aplicações em tecidos de plantas para a detecção óptica de espécies de nitrogênio e de oxigênio reativo. 31Uma aplicação particularmente interessante para sensores CoPhMoRe SWNT é o potencial para a detecção de etiqueta livre de neurotransmissores, tais como dopamina, in vivo, onde outras técnicas, tais como a detecção electroquímica ou imuno-histoquímica, sofrem de uma falta de resolução espacial, resolução temporal, e especificidade.
Projetando e descobrindo sensores CoPhMoRe SWNT até agora tem sido restringido pelo tamanho e química diversidade da biblioteca dispersante, limitando a probabilidade de encontrar um sensor para um alvo particular. Até à data, os investigadores apenas arranhamos a superfície do conjugado disponível, co-block, biológicos e polímeros biomiméticos que poderiam servir como dispersantes funcionalmente ativos para sensores SWNT. Aqui, apresentamos métodos diferentes, tanto para dispersar SWNTs e caracterizar sua fluorescência para triagem de alto rendimento e para a análise do sensor SWNT única. Especificamente, nós descrevem o procedimento para nanotubos de carbono de revestimento com oligom ácido polinucleicoers usando sonicação directo, bem como a forma de funcionalizar SWNT com polímeros anfifílicos através da troca de surfactante por diálise. Usamos (GT) 15 -ADN e polietileno glicol funcionalizado com rodamina isotiocianato (RITC-PEG-RITC) como exemplos. Nós demonstramos a utilização de (GT) 15 -ADN nanotubos de carbono como um sensor para a detecção CoPhMoRe de dopamina. Por fim, descrevem os procedimentos para a realização de medições do sensor molécula de solteiro, que podem ser utilizados para a caracterização ou simples detecção molécula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanotubos de carbono são prontamente suspenso em solução aquosa através de sonicação directa com SDS ou ADNcs, como indicado por um aumento na densidade óptica proporcionado pela dispersão coloidal do híbrido SWNT-polímero resultante. SDS e ssDNA dispersa e solubiliza feixes de nanotubos de carbono por adsorção na superfície do SWNT através de interacções hidrofóbicas ou pi-pi. Além disso, outros polímeros, tais como o ADN genómico, os polímeros anfifílicos, polímeros conjugados e lípidos, pode s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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