Engineering Molekylär igenkänning med Bio-mimetiska Polymers på Single vägg kolnanorör
Summary
We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.
Abstract
Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.
Introduction
Enkel vägg kolnanorör (SWNTs) är atom tunna skikt av kolatomer ihoprullade till långa, tunna cylindrar som uppvisar unika elektroniska och optiska egenskaper. 1 Sådana egenskaper inkluderar en bandgap producerar nära infraröd (NIR) fluorescensemission via exciton rekombination som är mycket känslig för sin omgivning. NIR utsläpp av SWNTs faller inom det nära infraröda fönster där inträngningsdjupet av ljus är maximal för biologisk vävnad. 2,3 Dessutom SWNTs uppvisar flera unika egenskaper atypiska i motsats till organiska fluoroforer: SWNT uppvisar en stor Stokes skift, inte photobleach, och inte blinkar. 4 Nyligen utnyttja dessa egenskaper har lett till utvecklingen av ett sortiment av nya molekylära sensorer med tillämpningar på biologi. 5,6 Oförändrad dock SWNTs är olösliga i vatten, och erhållande av suspensioner av enskilda SWNTs kan vara en utmaning. 7,8 Bundling och aggregering av SWNTs i lösning kan fördunkla deras bandgap fluorescens, 2 gör dem olämpliga för analystillämpningar.
Dispergering enskilda kolnanorör i vattenlösning kräver att ändra sin yta för att förhindra hydrofoba driven aggregering. 9 Även kovalent modifiering kan göra SWNTs vattenlösliga, 10 samt ger specifik bindnings kemi, defekta platser i SWNT gitter minska eller dämpa deras fluorescensemission. Istället kan SWNT-funktionalisering åstadkommas genom användning tensider, lipider, polymerer och DNA 9,11 – 13 som adsorberar till den nanotube ytan genom hydrofoba och pi-pi stapling interaktioner. Den resulterande kemiska miljön som omger ytfunktionaliserade SWNTs refereras till som dess corona fas. Störningar till coronafasen kan ha en stor inverkan på excitoner reser på nanotube ytan, vilket module att SWNT fluorescence emission. Det är denna känsliga förhållande mellan coronafasen och SWNT fluorescens som kan utnyttjas för att utveckla nya molekylära sensorer genom att införliva specifika bindnings modaliteter på den stora ytarean hos SWNT. Störningar till SWNT corona fasen vid bindning analyt kan leda till förändringar i den lokala dielektriska miljön, laddningsöverföring, eller införa gitterdefekter, som alla kan modulera fluorescensemissionen av SWNTs att fungera som en signalöverföringsmekanism. 14 Detta tillvägagångssätt används i utvecklingen av nya fluorescerande sensorer för detektering av många olika klasser av molekyler, inklusive DNA, 15,16 glukos 17 och små molekyler såsom ATP, 18 reaktiva syrespecies 19 och kväveoxid. 20,21 Men dessa metoder begränsade i att de förlitar sig på att det föreligger en känd bindnings modalitet för målanalyten.
Nyligen har en mer allmän appmört att utforma fluorescerande sensorer har utvecklats med SWNTs icke-kovalent funktionaliserade med amfifila heteropolymerer, fosfolipider och polynukleinsyror. Dessa molekyler adsorberas till Nanorör ytor för att producera mycket stabila suspensioner av enskilda SWNTs 22 – 25 med unika corona faser som specifikt kan binda proteiner 26,27 eller små molekyler inklusive signalsubstansen dopamin. 28-30 Engineering corona fasen för att skingra SWNTs och specifikt binder målanalyter kallas korona fas molekylär igenkänning (CoPhMoRe). 28 Den lilla storleken, låg toxicitet, hög stabilitet och unbleaching NIR fluorescens CoPhMoRe SWNT sensorer gör dem till utmärkta kandidater för in vivo avkänning under längre tidsupplösta mätningar. 6 Senaste arbete har visat sina tillämpningar inom växtvävnader för optisk detektering av reaktiva kväve- och syreradikaler. 31En särskilt spännande ansökan om CoPhMoRe SWNT sensorer är potentialen för etikett fri detektering av signalsubstanser som dopamin in vivo, där andra tekniker, såsom elektrokemisk avkänning eller immunohistokemi, lider brist på rumslig upplösning, tidsupplösning, och specificitet.
Designa och upptäcka CoPhMoRe SWNT sensorer hittills hämmats av den storlek och kemiska olikhet dispergeringsmedel biblioteket, vilket begränsar sannolikheten att hitta en sensor för ett särskilt mål. Hittills har forskare bara skrapat på ytan av tillgängliga konjugerade, co-blocket, biologiska och biomimetiska polymerer som skulle kunna fungera som funktionellt aktiva dispergeringsmedel för SWNT sensorer. Här presenterar vi olika metoder för både dispergering SWNTs och karakterisera deras fluorescens för high throughput screening och för enstaka SWNT sensoranalys. Specifikt vi beskriva förfarandet för beläggning SWNTs med polynukleinsyra oligomERS med direktultraljudsbehandling samt hur man funktionalisera SWNT med amfifila polymerer genom utbyte tensid genom dialys. Vi använder (GT) 15-DNA och polyetylenglykol funktionaliseras med rodaminisotiocyanat (RITC-PEG-RITC) som exempel. Vi visar användningen av (GT) 15-DNA SWNTs som en CoPhMoRe sensor för detektering av dopamin. Slutligen vi beskriva förfaranden för att utföra enkla molekyl sensormätningar, som kan användas för karakterisering eller enda molekyl avkänning.
Protocol
Representative Results
Discussion
SWNTs lätt suspenderas i vattenlösning via direkt sonikering med SDS eller ssDNA, såsom indikeras av en ökning i optisk densitet som tillhandahålls av kolloidal dispersion av den resulterande SWNT-polymer-hybrid. SDS och ssDNA sprider och solubiliserar buntar med SWNTs genom adsorption på SWNT ytan genom hydrofoba eller pi-pi interaktioner. Dessutom kan andra polymerer, såsom genomiskt DNA, amfifila polymerer, konjugerade polymerer och lipider, kan adsorberas på ytan av SWNTs genom dialys av prover upphängda me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.
Materials
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100k Da spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2d array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1d sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| wellplates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. . Carbon Nanotubes. 80, (2001).
- O’Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes–the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
