Describimos el aislamiento de la matriz extracelular cardíaca de ratones control C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5. También describimos los estudios de vasodilatación en los vasos aislados de C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5.
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Artículo de método
Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
El factor regulador del interferón 5 (IRF5) es crucial para que las células determinen si responden de manera proinflamatoria o antiinflamatoria. La capacidad de IRF5 para cambiar las células de una vía a otra es muy atractiva como diana terapéutica. Diseñamos un péptido señuelo IRF5D con un software de modelado molecular para el diseño de moléculas y péptidos pequeños.
IRF5D inhibió IRF5, redujo las alteraciones en la matriz extracelular y mejoró la vasodilatación endotelial en el ratón de piel tensa (Tsk/+). El Kd de IRF5D para IRF5 recombinante es de 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, determinado por experimentos de unión utilizando experimentos de interferometría de biocapas. La proliferación y apoptosis de las células endoteliales (CE) se mantuvieron sin cambios utilizando concentraciones crecientes de IRF5D (0 a 100 μg/mL, 24 h). Los ratones Tsk/+ fueron tratados con IRF5D (1 mg/kg/d por vía subcutánea, 21 d). Las expresiones de IRF5 e ICAM disminuyeron después del tratamiento con IRF5D. La función endotelial mejoró según la vasodilatación de las arterias faciales de los ratones Tsk/+ tratados con IRF5D en comparación con los ratones Tsk/+ sin tratamiento con IRF5D. Como factor de transcripción, IRF5 trafica desde el citosol hasta el núcleo. La translocación se evaluó mediante inmunohistoquímica en miocitos cardíacos cultivados en las diferentes matrices extracelulares cardíacas. El tratamiento con IRF5D del ratón Tsk/+ dio lugar a una reducción del número de núcleos positivos para IRF5 en comparación con los animales sin tratamiento con IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Estos hallazgos demuestran el importante papel que desempeña IRF5 en la inflamación y la fibrosis en ratones Tsk/+.
Introducción
Regulación del crecimiento celular y la respuesta inmune de muerte celular es fundamental para el papel de la familia de factores de transcripción de factores reguladores de interferón. IRF5 se pone de relieve como crucial para la regulación de la respuesta inmune entre el tipo 1, la promoción de una respuesta inflamatoria y tipo 2, una reparación de tejidos respuesta inmune de orientación. IRF5 es clave en el cáncer de 1, y la autoinmunidad 2, 3, 4, 5.
El ratón apretado-piel (Tsk /....
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Protocolo
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo (Protocolo: AUA # 1517). Todas las investigaciones con ratones se llevó a cabo de conformidad con la política PHS.
1. Diseño de Decoy Péptido
- Encuentra estructura 3D de la IRF5 y basar el diseño en él. Diseño de un 17 mer, denominado IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), donde aspartato (D) se sustituye por serina (S) para imitar la fosforilación en IRF5 en 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Análisis de grupos sulf....
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Resultados
Los resultados demostrados en la Figura 1 muestran cómo diseñar un péptido. La Figura 1, parte superior izquierda, muestra la región (entre las 2 flechas amarillas, los aminoácidos (aa) 425 a 436) en IRF5 que es fosforilada por una serie de quinasas. La figura 1, parte superior derecha, muestra un óvalo de color amarillo donde dominio fosforilada de IRF5 une. La estructura dimérica de 3DSH se hizo girar para observar una hendidura o vall.......
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Discusión
El objetivo era diseñar un inhibidor IRF5 para dilucidar el papel de IRF5 sobre la inflamación, fibrosis y la función vascular en los corazones de TSK / + ratones. Los resultados son que IRF5D no indujo la proliferación o la apoptosis. Por otra parte, la inflamación se redujo y la función vascular mejorada. Estos datos sugieren que IRF5 juega un papel mecanicista importante en el desarrollo de la inflamación y fibrosis en el corazón de TSK / + ratones y que tiene el potencial de servir como una diana terapéutica.
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) y HL-102836 (KAP) y Cimphoni Life Sciences (parte del salario de DW). Los autores agradecen a Meghann Sytsma por editar el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100 ml | |
| Alexa 488 con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra | Reactivo Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensores | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspasa-3/7 Sustrato | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Kit de ensayo | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) | Thermo Fisher | D-1306 | dilución 1:1.000 en PBS |
| burro anti ratas Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | dilución 1:1.000 en PBS |
| ECL más | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | Después de mucho ensayo y error, volvimos a este |
| Microscopio Eclipse TE 200-U con software de escaneo láser EZ C1 | Nikon | ||
| cabra anti conejo Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | dilución 1:1.000 en PBS |
| HRP anti-cabra | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10.000 dilución en TBS |
| HRP burro anti-ratón | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | dilución 1:10.000 en |
| TBS ICAM-1 anticuerpo | Cruz Biotechnologies | sc-1511 | dilución 1:200 en PBS |
| anticuerpo IRF5 (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Lector de microplacas Elx800 | Biotek | ||
| NIMP marcador de neutrófilos | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | dilución 1:200 en PBS |
| Octet RED | Forte Bio | proteína-proteína unión a proteína | |
| Diseño de péptidos Software Medit SA | RCSB.org | ||
| Síntesis de proteínas IRF5 recombinantes | TopGene Technologies | expresión de proteínas | |
| dodecilo fosfato de sodio | Sigma Aldrich | 436143 | detergente |
| Ketamina | Pharmacy | Schedule III sustancia controlada, se requiere presencia | |
| Xilacina | MedVet | ||
| 3.5X-45X Microscopio estereoscópico con zoom de disección trinocular con luces LED de cuello de cisne | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Columnas de desalinización Zeba | Thermofisher | 2161515 | |
| Endotelial Basal Media EBM Bullet kit El kit | Lonza | CC-3124 | contiene suplementos de crecimiento |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, Francia | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
Referencias
- Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
- Dideberg, V., et al.
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Reimpresiones y permisos
