Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane
Summary
L’obiettivo di questo studio era quello di formulare le tecnologie che permettono per la trasduzione del gene successo in primarie cellule natural killer (NK). La trasduzione lentivirale destrano-mediata di umani o risultati primari di cellule NK del mouse in una maggiore efficienza di espressione genica. Questo metodo di trasduzione del gene migliorerà notevolmente la manipolazione genetica delle cellule NK.
Abstract
La trasduzione efficiente di specifici geni in cellule natural killer (NK) è stata una sfida importante. Trasduzioni successo sono fondamentali per definire il ruolo del gene di interesse per lo sviluppo, la differenziazione e la funzione delle cellule NK. Gli avanzamenti recenti legati ai recettori chimerici antigene (automobili) nell’immunoterapia del cancro accentuano la necessità di un metodo efficiente trasportare geni esogeni di linfociti effettori. Le efficienze di trasduzioni lentivirali-mediata del gene in primari umani o cellule NK del mouse rimangano significativamente basse, che è un importante fattore limitante. Gli avanzamenti recenti utilizzando polimeri cationici, quali polybrene, mostrano un’efficienza di trasduzione migliorata gene in cellule di T. Tuttavia, questi prodotti non è riuscito a migliorare l’efficienza di trasduzione delle cellule NK. Questo lavoro mostra che destrano, un polisaccaride ramificato glucano, migliora notevolmente l’efficienza di trasduzione dell’essere umano e cellule NK primarie del topo. Questa metodologia di trasduzione altamente riproducibili fornisce uno strumento competente per trasdurre umano primarie cellule NK, che possono migliorare notevolmente le applicazioni cliniche gene consegna e così immunoterapia dei tumori basati su cellule NK.
Introduction
Cellule natural killer (NK) sono la popolazione linfocitaria principale del sistema immunitario innato1. Le cellule NK funzionano come i difensori di prima linea della risposta immunitaria contro i tumori e infezioni2,3,4. Le cellule NK svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di tolleranza attraverso la secrezione di potenti citochine e chemochine5. Grazie alla loro potente capacità di mirare ed eliminare le cellule tumorali, test clinici multipli vengono condotte per valutare donatore-derivati di cellule NK umane come un’immunoterapia adottiva per cancro6,7. Contrariamente alle cellule di T, la biologia dello sviluppo delle cellule di NK ha ancora essere ben caratterizzati8. Questa mancanza di conoscenza è parzialmente dovuto alla mancanza di tecniche efficienti che consegnare i geni di interesse al mouse o cellule NK primarie. Per questi motivi, la maggior parte delle cellule NK studi condotti in linee cellulari, piuttosto che in cellule primarie. Pertanto, la necessità di un protocollo affidabile ed efficiente di trasdurre primarie cellule NK con geni di interesse è fondamentale.
L’obiettivo generale di questo studio era di formulare un metodo coerente e affidabile con cui le cellule NK umane o murine primarie potrebbero essere trasdotte con lenti – o retrovirus.
Sono stati effettuati studi precedenti che hanno tentato di risolvere questo problema, in gran parte utilizzando la trasformazione transitoria primarie delle cellule di NK. Questo include il plasmide transfezione9,10, Virus di Epstein – Barr (EBV) / ibrido retroviral vector11, vaccinia virus file vettoriale12,13e Ad5/F35 vettori adenovirali chimerico14. Nonostante la modesta efficienza di queste tecniche, la natura transitoria della trasduzione li rende inadatti per l’utilizzo a lungo termine delle cellule NK geneticamente modificate. Alcuni studi recenti hanno utilizzato vettori retrovirali trasduce le cellule NK, che richiedono più cicli di infezione per raggiungere un livello accettabile di espressione genica11,15. In contrasto con vettori retrovirali, vettori lentivirali possono utilizzare macchinari di importazione nucleare cellula ospite per il complesso di pre-integrazione virale di traslocano nel nucleo. Si tratta di un importante fattore limitante nella replicazione del virus nelle cellule di divisione, che comprendono le cellule NK primarie.
Interazioni tra diversi recettori della superficie cellulare e particelle virali consentono l’assorbimento virale nella cellula. L’iniziali impegni fra le proteine dell’envelope virale ed i loro ricevitori cognate host potrebbero essere limitati a causa del potenziale cariche negative esistenti tra questi due. La spiegazione razionale dietro molte tecniche di trasduzione è che l’aggiunta di polimeri cationici, quali polybrene (Pb), solfato di protamina (PS) o destrano, potrebbe dare una carica positiva per i recettori della superficie cellulare e quindi aumentare l’associazione dell’envelope virale proteine. Ciò aumenterà l’efficienza di fusione e l’assorbimento delle particelle virali dai cellule16. Anche se è stato segnalato che Pb o PS può migliorare il trasferimento genico in cellule T17, loro applicazione non ha alcun effetto dell’efficienza di trasduzione delle cellule NK primarie. Inoltre, non è stata eseguita un’analisi comparativa tra questi reagenti utilizzando cellule NK primarie. In questo studio, sono state confrontate le efficienze di trasduzione dei tre polimeri cationici. I risultati mostrano che, tra questi tre polimeri cationici, solo destrano migliora significativamente efficiente trasduzione virale in cellule NK primarie sia il mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio dimostra che l’uso di destrano come un agente di polimero cationico migliora l’efficienza di trasduzione lentivirale sia murine ed umane primarie delle cellule di NK. Inoltre, altri agenti cationici, quali Pb o PS, non avere alcun effetto visibile sulla fornitura di vettori virali in cellule NK primarie. In precedenza, è stato dimostrato che il Pb può aumentare trasduzione del gene umano di cellule T17. Questi risultati, tuttavia, indicano che Pb né PS hanno una simile efficienza …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Lucia Sammarco e sua Lulu limonata Stand per ispirazione, motivazione e supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH R01 AI102893 e NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); l’Alex Lemonade Stand della Fondazione (S.M.); il programma HRHM del fondo MACC (S.M.; S.R.; MANGIAGLI); la Fondazione di famiglia Nicholas (S.M.); la famiglia Gardetto (S.M.); gli studiosi di Hyundai programmare (M.S.T); Hyundai speranza su ruote (S.R.); il fondo MACC (M.S.T e S.M.); Istituto di ricerca dei bambini, MCW (S.R.); e il premio di Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
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