In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

Interactie tussen moleculen is de basis van de natuur. Vandaar dat wetenschappers op vele terreinen van fundamenteel en toegepast onderzoek proberen om de fundamentele principes van de moleculaire interacties van verschillende soorten te begrijpen. Microschaal Thermophoresis (MST) kunnen wetenschappers de snelle, nauwkeurige, kostenefficiënte en op kwaliteit gecontroleerde karakterisering van moleculaire interacties uit te voeren in een oplossing, met een vrije keuze van buffers. Er zijn al meer dan 1.000 publicaties met behulp van MST, van 2016 alleen al, de beschrijving van verschillende soorten analyses, met inbegrip van de bibliotheek screenings, bindende event validaties, de concurrentie assays, en experimenten met meerdere bindende partners ^1-8. Over het algemeen MST maakt de studie van de klassieke bindingsparameters, zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM), stoichiometrie en thermodynamica, van elke soort moleculaire interactie. Een groot voordeel van MST is het vermogen binding gebeurtenissen onafhankelijk van de grootte van de interactiepartners bestuderen. zelfs challenging interacties tussen kleine nucleïnezuur aptameren (15-30 nt) en targets zoals kleine moleculen, geneesmiddelen, antibiotica, of metabolieten kunnen worden gekwantificeerd.

De huidige state-of-the-art technologieën te karakteriseren aptameer-target interacties ofwel lab-intense en zeer complexe of niet te kwantificeren aptameer-klein molecuul interacties ^9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) gebaseerde assays ^11,12 en echt label-free calorimetrische benaderingen, zoals Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) ^13-15, isocratische elutie ^16, evenwicht filtratie ^17,18, in-line sonderen ^19, gel- shift assays, stoppunt fl ow fluorescentie-spectroscopie ^20,21, fluorescentie anisotropie (FA) ^22,23, single-molecule fluorescentie beeldvorming ^24,25, en Bio-layer interferometrie (BLI) ²⁶ zijn ook ofwel onnauwkeurig of niet verenigbaar met aptameer-klein molecuul interacties. andere principal vraagstukken van deze methoden zijn lage gevoeligheid, hoge monster verbruik, immobilisatie, massatransport beperkingen op oppervlakken, en / of buffer beperkingen. Slechts een paar van deze technologie te bieden geïntegreerde schakelaars voor aggregatie en adsorptie effecten.

MST is een krachtig hulpmiddel voor wetenschappers om deze beperking op de interactie tussen aptameren en kleine moleculen ^27-29, alsmede andere doelen zoals eiwitten ^30-33 bestuderen overwonnen. De technologie is gebaseerd op de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten. Deze gerichte beweging, genaamd "thermophoresis," afhankelijk van de grootte, lading en hydratatie shell van het molecuul ^34,35. De binding van een ligand aan het molecuul direct ten minste één van deze parameters verandert, wat resulteert in een veranderde mobiliteit thermophoretic. Liganden met kleine maten kan geen aanzienlijke gevolgen in termen van grootte veranderen van de niet-gebonden aan de gebonden toestand, maar ze kunnen dr hebben amatic effecten op de hydratatie shell en / of kosten. De veranderingen in de thermophoretic beweging van moleculen na interactie met de bindende partner maakt de kwantificering van fundamentele bindingsparameters ^{2,7,34,36,37.}

Zoals weergegeven in figuur 1A, de MST inrichting bestaat uit een infrarood laser gefocust op het monster in de glazen capillairen met dezelfde optiek als voor fluorescentiedetectie. De thermophoretic beweging van eiwitten via de intrinsieke fluorescentie van tryptofaan ⁶ of een fluorescent gelabelde interactiepartner ^3,8 kan worden bewaakt terwijl de laser wordt een temperatuurgradiënt (AT van 2-6 ° C). Het resulterende temperatuurverschil in de ruimte, AT, leidt tot de uitputting of accumulatie van moleculen in het gebied van verhoogde temperatuur, die kan worden gekwantificeerd door de Soret coëfficiënt (S _T):

g "/>

c _hete geeft de concentratie in het verwarmde gebied, en c _koud de concentratie in de oorspronkelijke koud gebied.

Zoals getoond in figuur 1B, een typische MST experiment resulteert in een MST bewegingsprofiel (tijddiagram), bestaande uit verschillende fasen, die gescheiden kunnen worden door hun respectieve tijdschema. De initiële fluorescentie gemeten in de eerste 5 s bij afwezigheid van de temperatuurgradiënt de precieze start fluorescentie definiëren en controleren fotobleken of photoenhancement. De temperatuursprong (T-Jump) vertegenwoordigt de fase waarin de fluorescentieveranderingen voor thermophoretic beweging. Deze initiële afname in fluorescentie afhankelijk warmte-afhankelijke veranderingen van fl uorophore kwantumopbrengst. De thermophoresis fase volgt, waarbij de fluorescentie afneemt (of verhogingen) door de thermophoretic beweging van de molecules tot de steady-state verdeling wordt bereikt.Het omgekeerde TJump en gelijktijdige terugdiffusie van fluorescerende moleculen zoals aangegeven in figuur 1B nadat de laser is uitgeschakeld worden waargenomen. Om bij fundamentele bindingsparameters worden verschillende molaire verhoudingen van de interactiepartners geanalyseerd en vergeleken. Gewoonlijk worden 16 verschillende ratio's bestudeerd in een MST experiment, terwijl de optische zichtbaar molecuul constant wordt gehouden en wordt geleverd met een toenemende hoeveelheid van de niet-gelabelde ligand. De interactie tussen de twee bindingspartners induceert veranderingen in de thermophoresis, en dus de genormaliseerde fluorescentie, F _norm, die wordt berekend als volgt:

F _warme en _koude F vertegenwoordigen gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de gedefinieerde tijdstippen van het MST sporen. Bindende affiniteiten _(Kd of EC ₅₀ waarden) kan worden berekend door curve fitting (figuur 1C).

Over het geheel genomen MST is een krachtig hulpmiddel om de moleculaire interacties van welke aard dan ook te bestuderen. Dit manuscript biedt een protocol bij de uitdagende interactie te karakteriseren tussen de kleine molecule adenosine trifosfaat (ATP; 0,5 kDa) en de 25-nt korte ssDNA aptameer DH25.42 (7,9 kDa). In de loop van het manuscript wordt de bindingsplaats van de aptameer aan het ATP molecuul in kaart gebracht naar de adenine groep van ATP.

Protocol

1. Voorbereiding van de aptameer werken Stock De instructies van de fabrikant en los het oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sequentie uit referentie 18) in water, tot een 100-uM eindconcentratie. Bereid de aptameer werkende oplossing door verdunning van de oligonucleotide voorraad tot 200 nm met bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,01% Tween 20). Incubeer het mengsel gedurende 2 minuten bij 90 ° C, laat het monster onmiddel…

Representative Results

Bij deze studie werd MST aangebracht op de bindingsplaats van de DH25.42 DNA aptameer 18 karakteriseren op ATP. In tegenstelling tot andere studies karakteriseren van de interactie van ATP of ATP lijkende kleine moleculen eiwitten willekeurig gemerkt met één of meer fluoroforen 38-40 Deze studie omvat een gemerkte versie van het 7,9 kDa ssDNA aptameer met een Cy5 molecuul op het 5'- uiteinde . Verschillende ATP derivaten en verwante moleculen, alle verschillen…

Discussion

Kwaliteitscontroles:

Aspecifieke plakken / adsorptie van monstermateriaal op oppervlakken en aggregatie effecten, een wezenlijke invloed op de kwaliteit van de affiniteit gegevens. Slechts enkele state-of-the-art technologieën bieden een nauwkeurige en snelle opties te controleren en deze te vermijden. MST biedt geïntegreerde kwaliteitscontroles die detecteren en helpen om deze problemen te overwinnen, waardoor de stapsgewijze optimalisatie van de technische installatie. Belangrijke informati…

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software