La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

L'interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame con partner multipli vincolanti ^1-8. In generale, MST consente lo studio dei parametri vincolanti classici, come affinità di legame (pM a mM), stechiometria e termodinamica, di qualsiasi tipo di interazione molecolare. Un grande vantaggio di MST è la capacità di studiare eventi di legame indipendenti dalla dimensione dei partner di interazione. anche Chalinterazioni lenging tra piccole aptameri di acidi nucleici (15-30 nt) e target, quali piccole molecole, farmaci, antibiotici, o metaboliti possono essere quantificati.

Le attuali tecnologie state-of-the-art di caratterizzare le interazioni aptamer bersaglio sono o laboratorio-intenso e molto complesso o non riescono a quantificare aptameri-piccola molecola Interazioni ^9,10. Risonanza plasmonica di superficie (SPR) a base di test di ^11,12 e approcci calorimetrica veramente libero-label, come Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) ^13-15, eluizione isocratica ^16, equilibrio filtrazione ^17,18, in linea di sondaggio ^19, gel- spostare saggi, stopped- flusso fluorescenza spettroscopia ^20,21, anisotropia di fluorescenza (FA) ^22,23, singola molecola fluorescenza di imaging ^24,25, e Bio-strato di interferometria (BLI) ²⁶ siano anche imprecisi o incompatibile con la molecola aptameri-piccole interazioni. Altro Principal temi di questi metodi sono bassa sensibilità, elevato consumo di campione, l'immobilizzazione, limitazioni di trasporto di massa su superfici e / o limitazioni del buffer. Solo pochi di queste tecnologie forniscono controlli integrati per aggregazione e di adsorbimento effetti.

MST rappresenta un potente strumento per gli scienziati di superare questa limitazione per studiare le interazioni tra aptameri e piccole molecole ^27-29, nonché altri obiettivi come le proteine ^30-33. La tecnologia si basa sul movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura. Questo movimento diretto, chiamato "termoforesi," dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione della molecola ^34,35. Il legame di un ligando alla molecola modificherà direttamente almeno uno di questi parametri, con un conseguente mobilità thermophoretic cambiato. Ligandi con le piccole dimensioni non possono avere un notevole impatto in termini di cambio formato dal non associata alla stato legato, ma possono avere dr effetti Amatic sul guscio di idratazione e / o carica. I cambiamenti nel movimento delle molecole thermophoretic dopo interazioni con il partner legante consente la quantificazione dei parametri vincolanti di base ^{2,7,34,36,37.}

Come illustrato in figura 1A, il dispositivo MST costituito da un laser a infrarossi focalizzato sul campione entro i capillari di vetro con la stessa ottica come per la rilevazione della fluorescenza. Il movimento thermophoretic delle proteine tramite fluorescenza intrinseca di triptofani ⁶ o di un ^3,8 socio interazione fluorescente può essere monitorato mentre il laser stabilisce un gradiente di temperatura (DT di 2-6 ° C). La differenza di temperatura risultante nello spazio, DT, porta alla deplezione o accumulo di molecole nella zona di temperatura elevata, che può essere quantificato dal Soret coefficiente (S _T):

g "/>

c rappresenta _caldo la concentrazione nella regione riscaldata, ec _freddo è la concentrazione nella regione fredda iniziale.

Come mostrato nella Figura 1B, un tipico esperimento MST ottiene un profilo di movimento MST (traccia temporale), costituito da diverse fasi, che possono essere separati dai rispettivi tempi. La fluorescenza iniziale è misurata nei primi 5 s in assenza del gradiente di temperatura per definire la precisione di fluorescenza iniziale e per controllare photobleaching o photoenhancement. Il salto di temperatura (T-Jump) rappresenta la fase in cui le variazioni di fluorescenza prima del movimento thermophoretic. Questa diminuzione iniziale della fluorescenza dipende da sbalzi termici-dipendente di fl uorophore resa quantica. La fase termoforesi segue, in cui diminuisce fluorescenza (o aumenta) dovuti al movimento thermophoretic delle molecole fino alla distribuzione dello stato stazionario viene raggiunto.Il tjump retromarcia e retrodiffusione concomitante di molecole fl uorescenti possono essere osservati come indicato in Figura 1B dopo il laser è spento. Per accedere ai parametri di base vincolanti, diversi rapporti molari dei partner di interazione sono analizzati e confrontati. Tipicamente, 16 differenti rapporti sono studiati in un esperimento MST, considerando che la molecola visibile ottica viene mantenuta costante ed è fornita con una quantità crescente di ligando non marcato. L'interazione tra i due partner di legame induce cambiamenti nella termoforesi, e quindi nella fluorescenza normalizzato, F _norma, che viene calcolato come segue:

F _calda e _fredda F rappresentano una media di fl intensità fluorescenza a de fi nite momenti delle tracce MST. Affinità di legame (K _D o valori di EC ₅₀₎ possono essere calcolati curve montaggio (Figura 1C).

Nel complesso, MST è un potente strumento per studiare le interazioni molecolari di qualsiasi tipo. Questo manoscritto offre un protocollo per caratterizzare l'interazione sfida tra la piccola molecola di adenosina trifosfato (ATP; 0,5 kDa) e il 25-nt breve ssDNA aptameri DH25.42 (7,9 kDa). Nel corso del manoscritto, il sito di legame del aptamer sulla molecola ATP viene mappato verso il gruppo adenina dell'ATP.

Protocol

1. Preparazione del lavoro Aptamero l'Archivio Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento 18) in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron. Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween20). Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasci…

Representative Results

In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 18 ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l'interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori 38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull'estremità 5' . Diversi derivati ​​ATP e molecole correlate, che differiscono da A…

Discussion

Controlli di qualità:

Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l'ottimizzazione graduale della configurazione …

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software