Kartlegging av bindingssetet på en Aptamer på ATP Bruke mikro termodiffusjon

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

Interaksjon mellom molekylene er grunnlaget for naturen. Derfor forskere i mange felt av grunnleggende og anvendt forskning prøve å forstå de grunnleggende prinsippene i molekylære interaksjoner av ulike slag. Mikro termodiffusjon (MST) gjør det mulig for forskere å utføre raske, presise, kostnadseffektive og kvalitetssikret karakterisering av molekylære interaksjoner i løsning, med et fritt valg av buffere. Det er allerede mer enn 1000 publikasjoner bruke MST, fra 2016 alene, som beskriver ulike typer analyser, inkludert bibliotek screenings, bindende event valideringer, konkurranseanalyser, og eksperimenter med flere bindingspartnere ^1-8. Generelt tillater MST studiet av de klassiske bindende parametere, slik som bindingsaffinitet (pM til mM), støkiometri, og termodynamikk, av en hvilken som helst form for molekylær interaksjon. En stor fordel med MST er evnen til å studere bindings hendelser uavhengig av størrelsen på interaksjonspartnere. selv utfordrende interaksjoner mellom små nukleinsyre aptamerer (15-30 nt) og mål som små molekyler, narkotika, antibiotika, eller metabolitter kan kvantifiseres.

Nåværende state-of-the-art teknologi for å karakterisere aptamer-målet interaksjoner er enten lab-intens og svært komplekse eller unnlater å kvantifisere aptamer-lite molekyl interaksjoner ^9,10. Surface plasmonresonans (SPR) -baserte analyser ^11,12 og virkelig label-free kalori tilnærminger, for eksempel Isoterm Titrering kalorimetri (ITC) ^13-15, isokratisk eluering ^16, likevekt fi filtrering ^17,18, in-line sondering ^19, gel- skifte analyser, stopped- fl ow fl uorescence spektroskopi ^20,21, fluorescens anisotropi (FA) ^22,23, single-molekyl fl uorescence bildebehandling ^24,25, og Bio-lag interferometri (BLI) ²⁶ er også enten upresis eller uforenlig med aptamer-lite molekyl interaksjoner. andre Principal utgaver av disse metodene er lav følsomhet, høy prøven forbruk, immobilisering, massetransportbegrensninger på overflater, og / eller buffer restriksjoner. Bare et fåtall av disse teknologiene gir integrerte kontroller for aggregering og adsorpsjon effekter.

MST representerer et kraftig verktøy for forskere å overvinne denne begrensningen for å studere interaksjoner mellom aptamerer og små molekyler ^27-29, samt andre mål, for eksempel proteiner ^30-33. Teknologien baserer seg på bevegelse av molekyler gjennom temperaturgradienter. Dette rettet bevegelse, kalt "termodiffusjon", avhenger av størrelse, ladning, og hydrering skall av molekylet ^34,35. Binding av en ligand til molekylet vil direkte endre i det minste én av disse parametre, noe som resulterer i en endret termoforetiske mobilitet. Ligander med små størrelser kan ikke ha store konsekvenser i forhold til størrelse endring fra ubundet til bundet tilstand, men de kan ha dr amatic effekter på hydrering skall og / eller kostnad. Endringene i den termoforetiske bevegelighet av molekylene etter interaksjon med bindingspartneren muliggjør kvantifisering av grunnleggende bindingsparametere ^{2,7,34,36,37.}

Som vist i figur 1A, MST enheten består av en infrarød laser fokusert på prøven innenfor glasskapillærer ved hjelp av de samme optikk som for fluorescensdeteksjon. Den termo bevegelse av proteiner via den iboende fl uorescence av tryptofaner ⁶ eller av et fluorescensmerket interaksjon partner ^3,8 kan overvåkes mens laseren etablerer en temperaturgradient (aT på 2-6 ° C). Den resulterende temperaturforskjell på plass, AT, fører til uttømming, eller oppsamling av molekyler i området av forhøyet temperatur, som kan kvantifiseres ved Soret COEF fi sient (S _T):

g "/>

c _varm utgjør den konsentrasjon i det oppvarmede område, og c _kulde er konsentrasjonen i den innledende kald region.

Som vist i figur 1B, en typisk MST eksperimentresultatene i en MST bevegelse profil (tid kurve), som består av forskjellige faser, som kan separeres ved deres respektive tidsrammer. Den innledende fluorescensen måles i de første 5 s i fravær av temperaturgradienten for å definere den nøyaktige utgangs fluorescensen og for å se etter fotobleking eller photoenhancement. Temperatur Jump (T-Jump) representerer den fasen hvor fluorescens endringene før termo bevegelse. Denne første nedgang i fluorescens er avhengig av varmeavhengige endringer av fl uorophore kvanteutbytte. Den termodiffusjon fase følger, hvor fluorescens-lavere (eller høyere) på grunn av den termoforetiske bevegelighet av molekylene inntil steady-state fordeling er oppnådd.Det motsatte TJump og samtidig tilbakediffusjon av fl uorescent molekyler kan observeres som vist i figur 1B etter at laseren er skrudd av. For å få tilgang til basisbindingsparametere, blir forskjellige molare forhold av interaksjonspartnere analysert og sammenlignet. Vanligvis er 16 forskjellige forhold studert i en MST eksperiment, mens den optiske synlig molekylet holdes konstant og er utstyrt med en økende mengde av umerket ligand. Samspillet mellom de to bindingspartnere induserer endringer i termodiffusjon, og således i den normaliserte fl uorescence, F _norm, som beregnes som følger:

F _varm og F _kald representerer gjennomsnitt fl uorescence intensiteter på de fi nert tidspunkter av MST spor. Bindingsaffiniteter (K _d eller EC ₅₀ verdier) kan beregnes ved curve montering (figur 1C).

Samlet er MST et kraftig verktøy for å studere molekylære interaksjoner av noe slag. Dette manuskriptet har en protokoll for å karakterisere utfordrende samspill mellom den lille molekylet adenosintrifosfat (ATP, 0,5 kDa) og 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). I løpet av manuskriptet er bindingssetet for aptamer på den ATP-molekylet tilordnet ned til adenin gruppen av ATP.

Protocol

1. Klargjøring av Aptamer Working Stock Følg produsentens instruksjoner og oppløse oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens fra referanse 18) i vann, og nådde en 100-mikrometer endelig konsentrasjon. Klargjør aptamer arbeidsløsning ved å fortynne oligonukleotid lager til 200 nM med bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,01% Tween 20). Inkuber blandingen i 2 minutter ved 90 ° C, la prøven umiddelbart avkjølt på is, …

Representative Results

I denne studien ble MST brukt for å karakterisere bindingssetet av DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I motsetning til andre studier som karakteriserer interaksjonen av ATP eller ATP-ligne små molekyler med proteiner tilfeldig merket med en eller flere fluoroforer 38-40, omfatter denne studien en merket versjon av det 7,9 kDa ssDNA aptamer med en Cy5 molekyl på 5 'enden . Forskjellige ATP-derivater og beslektede molekyler, som alle er forskjellig fra ATP i ulike…

Discussion

Kvalitetskontroller:

Uspesifikke klebing / adsorpsjon av prøvemateriale til overflatene, i tillegg til aggregering effekter, ha en dramatisk innvirkning på kvaliteten av de data affinitet. Men bare noen få state-of-the-art teknologi tilbyr nøyaktige og raske alternativer for å overvåke og unngå disse effektene. MST tilbyr integrerte kvalitetskontroller som gjenkjenner og bidrar til å overvinne disse problemene, slik at for trinnvis optimalisering av tekniske oppsettet. Viktig informasjo…

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software