والفئران مثلي المثانة نموذج ورم والورم نظام لكشف
Summary
يصف هذا البروتوكول جيل من الفئران أورام المثانة مثلي في الإناث C57BL / 6J الفئران ورصد نمو الورم.
Abstract
يصف هذا البروتوكول توليد أورام المثانة لدى الفئران C57BL / 6J الإناث باستخدام الفئران خط خلية سرطان المثانة MB49، الذي تم تعديله لإفراز البروستاتا البشرية محددة مستضد (PSA)، وإجراءات التأكد من زرع الورم. باختصار، يتم تخدير الفئران باستخدام المخدرات عن طريق الحقن ومصنوعة لوضع في موقف الظهرية. وأخلى البول من المثانة و 50 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (PLL) وتغرس ببطء بمعدل 10 ميكرولتر / 20 ق باستخدام القسطرة 24 G الرابع. فإنه لا يتبقى في المثانة لمدة 20 دقيقة قبل stoppering القسطرة. تتم إزالة القسطرة وجلت PLL بواسطة ضغط لطيف على المثانة. ويعقب ذلك تقطير خط خلية سرطان المثانة الفئران (1 × 10 5 خلية / 50 ميكرولتر) بمعدل 10 ميكرولتر / 20 ق. ومقفول القسطرة لمنع إخلاء سابق لأوانه. بعد 1 ساعة، وإحياء الفئران بعقار انعكاس، وأخلت المثانة. معدل تقطير بطيء مهم،كما أنه يقلل من الجزر المثاني الحالبي، والتي يمكن أن تسبب الأورام تحدث في المسالك البولية العلوي وفي الكلى. خط الخلية يجب أيضا إعادة وقف التنفيذ للحد من التثاقل من الخلايا، وهذا يمكن أن يؤدي إلى أحجام الأورام متفاوتة بعد الزرع.
هذه التقنية تحرض الأورام بكفاءة عالية. ويتم رصد نمو الورم عن طريق إفراز دعم البرامج والإدارة البولية. مراقبة PSA علامة هو أكثر موثوقية من الموجات فوق الصوتية أو التصوير مضان للكشف عن وجود أورام في المثانة. الأورام في الفئران تصل عموما حجم أقصى يؤثر سلبا على الصحة بنحو 3-4 أسابيع إذا تركت دون علاج. من خلال رصد نمو الورم، فمن الممكن أن نفرق الفئران التي تم علاجها من تلك التي لم تزرع بنجاح مع الأورام. مع تحليل نقطة النهاية الوحيد، وهذا الأخير يمكن افتراض خاطئ قد تم علاجه عن طريق العلاج.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو توليد أورام المثانة مثلي الفئران ورصد الأورام مزروع بأكبر قدر ممكن، حتى لا يعتقد أن الفئران دون زرع الورم قد تم علاجه في تحليل نقطة النهاية. وعموما، فإن طريقة أظهرت سوف يقلل من الحاجة لأعداد كبيرة من الفئران لتحليل تجريبي وضمان المزيد من الدقة في تحديد النتائج العلاجية.
تطوير نموذج مثلي لسرطان مهمة، كما زرع خلايا الورم تحت الجلد لا ألخص البيئة من المرض السريري أو تمكين وضع استراتيجيات علاجية. بنية المثانة يسمح للتقطير من علاجات سرطان المثانة مباشرة في المثانة مع تأثيرات جهازية الحد الأدنى. وبالتالي، نماذج حيوانية أن ألخص هذه البيئة، مثل نموذج مثلي، هي مهمة لتقييم علاجات جديدة. وdependen الاستنتاجات المستخلصة من أي انشاء التجريبيةر على القيود المفروضة على النموذج.
وقد تم تطوير العديد من التقنيات لإنتاج أورام المثانة مثلي في الفئران. هذه تعتمد على إتلاف طبقة جلايكان المثانة، مما يتيح الخلايا السرطانية ليكون مزروع. وتشمل التقنيات المستخدمة كهربي، مما يؤدي الى نقطة واحدة من الضرر في جدار المثانة، مما يؤدي إلى نمو الورم في موقع واحد في المثانة 1،2. ومع ذلك، فإن نسبة نجاح زرع الورم باستخدام كهربي يعتمد مشغل متفاوتة 10-90٪، ويشمل الخطر الذي جدار المثانة سيتم ثقب، مما يؤدي إلى أورام النامية في التجويف البريتوني. يتم تنفيذ الكي الكيميائي باستخدام نترات الفضة، الامر الذي يسيء الى جدار المثانة 3. وبالمثل، وقد استخدم حمض إلى تلف جدار المثانة 4. كما تم استخدام التربسين إلى تلف المثانة وكذلك 5. قد ينتج عن هذه الأساليب في تطوير الورم أكثر من واحد في المثانة.وعلاوة على ذلك، هناك خطر حدوث أضرار بالغة في المثانة إذا ترك المواد الكيميائية في اتصال مع جدار المثانة لفترة طويلة جدا. الطريقة التي وضعتها Ninalga وآخرون. يستخدم موجبة بولي-L-ليسين (PLL) 6 الجزيئات إلى طبقة جدار المثانة. وهذا يتيح لخلايا الورم المشحونة سلبا على التمسك طبقة جلايكان المثانة. هذه الطريقة عموما النتائج في الورم أكثر من واحد النامية في المثانة، ولكن الورم غرس هو في 80-100٪ 4،7. من الناحية الفنية، بل هو أيضا أسهل طريقة لأداء. لضمان أن الأورام التي تنشأ هي إلى حد ما حتى في الحجم، من المهم أن الخلايا السرطانية لا تجميعها في كتل كبيرة قبل الزرع.
من أجل تقييم فعالية العلاج، فمن الأفضل لأداء هذه الدراسة على الفئران بأورام مماثلة الحجم إلى حد ما. وهكذا، فإن نظام الكشف الجيدة التي يمكن قياس حجم الورم قريبا بعد زرع مهم. العديد من الاستراتيجيات لها النحلن المستخدمة لتقييم الأورام. وتشمل هذه التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 10/08، مضان 11، تلألؤ بيولوجي 12،13، الموجات فوق الصوتية 14، وانزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) 15،16. بينما التصوير بالرنين المغناطيسي والموجات فوق الصوتية لا تتطلب إدخال تعديلات على الخلايا السرطانية، وهناك حاجة إلى معدات والتباين وكلاء حساسة للتصوير بالرنين المغناطيسي. تتطلب فحوصات fluorescence-، luminescence-، واستنادا ELISA-تعديل الخلايا السرطانية للتعبير عن البروتينات علامة التي يمكن الكشف عنها من قبل هذه الأساليب. لالتلألؤ، مطلوب ركيزة للكشف عن luciferase النشاط. وبالتالي، هناك خطوة إضافية وزيادة تكلفة. كل من التألق ومضان يتطلب معدات متخصصة. لإنتاج مضان، الأخضر بروتين فلوري (GFP) cyclization، الذي يحفزه الأكسجين الجزيئي، مطلوب. وبالتالي، قد يكون التعبير GFP متغير داخل كتلة الورم اعتمادا على الحصول على الأكسجين، مما يجعل هذا علامة لا يمكن الاعتماد عليها بدلا <sup> 17. تعديل الفئران خط خلية سرطان المثانة MB49 لإفراز البروستاتا البشرية مستضد النوعي (PSA) 15،16 كمؤشر بديل هو استراتيجية أخرى. كما توفر هذه العلامات وسيلة بديلة لتأكيد وجود ورم في إنهاء التجربة، مما يجعلها بديلا لالمناعية. تعرض هذه الدراسة المنهج PLL زرع ورم مثلي وتقدم مقارنة بين أنظمة الكشف عن الورم، وهي ELISA، مضان، والتصوير بالموجات فوق الصوتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي 1) الحفاظ بنجاح tumorigenicity من خط الخلية. 2) ضمان إفراز دعم البرامج والإدارة للقياس قبل زرع الخلايا السرطانية في الفئران. 3) توليد تعليق خلية واحدة لزرع ذلك للحد من التباين في حجم الورم. و4) غرس الخلايا بمعدل بطيء لمنع المثاني الحالبي، ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O’Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette–Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O’Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
