Опухоль Модель и опухолевой мышиной цистопластики Система обнаружения
Summary
Этот протокол описывает генерацию мышиных опухолей цистопластики у самок C57BL / 6J и мониторинг роста опухоли.
Abstract
Этот протокол описывает генерацию опухолей мочевого пузыря у самок C57BL / 6J мышей с использованием мышиных клеток рака мочевого пузыря линии MB49, который был модифицирован секретируют человеческого простат-специфического антигена (ПСА), а также порядок подтверждения имплантации опухоли. Короче говоря, мышей анестезируют с помощью инъекционных препаратов и сделаны лежать в положении лежа на спине. Моча освобождено из мочевого пузыря и 50 мкл поли-L-лизин (PLL) медленно закапывают со скоростью 10 мкл / 20 с помощью катетера 24 G IV. Он остается в мочевом пузыре в течение 20 мин с помощью укупоривая катетера. Катетер удаляют и ФАПЧ освобождаемые мягкое давление на мочевой пузырь. За этим следует закапывания мышиной линии клеток рака мочевого пузыря (1 х 10 5 клеток / 50 мкл) со скоростью 10 мкл / 20 с. Катетер закупоривают для предотвращения преждевременной эвакуации. Через 1 ч мышей возродил с лекарственным средством реверсирования, и мочевой пузырь освобождается. Медленная скорость закапывания важно,так как это уменьшает пузырно-мочеточниковый рефлюкс, который может вызывать опухоли происходить в верхних мочевых путей и в почках. Клеточная линия должна быть хорошо ресуспендировали уменьшить слипание клеток, так как это может привести к неравномерному размеров опухоли после имплантации.
Этот метод вызывает опухоли с высокой эффективностью. Рост опухоли контролировали секреции мочевой PSA. Мониторинг ПСА маркером является более надежным, чем ультразвук или флуоресцентных изображений для обнаружения присутствия опухолей в мочевом пузыре. Опухоли у мышей обычно достигают максимального размера, что негативно влияет на здоровье около 3 – 4 недель, если не лечить. Контролируя рост опухоли, можно дифференцировать мышей, которые были вылечены от тех, которые не были успешно имплантировали опухоли. Только с анализа конечной точки, последняя может быть ошибочно предполагается, что были вылечены с помощью терапии.
Introduction
Цель этого метода заключается в создании мышиный Ортотопическая опухолей мочевого пузыря и следить за имплантированных опухолей настолько точно, насколько это возможно, так что у мышей без имплантации опухоли не думали, были вылечены при анализе конечной точки. В целом, способ, показанный уменьшит потребность в большом количестве мышей для экспериментального анализа и обеспечения большей точности при определении терапевтических результатов.
Развитие ортотопической модели рака важно, так как имплантировать опухолевые клетки подкожно не перепросматривать окружающую среду клинического заболевания или способствовать развитию терапевтических стратегий. Архитектура мочевого пузыря позволяет инстилляции рака мочевого пузыря терапии непосредственно в мочевой пузырь с минимальным количеством системных эффектов. Таким образом, животные модели, которые Повторим эту среду, такие как ортотопической, имеют важное значение для оценки новых методов лечения. Выводы, сделанные из любой экспериментальной установки являются dependenт при ограничениях модели.
Несколько методов было разработано для производства ортотопической опухолей мочевого пузыря у мышей. Они полагаются на повреждения гликозаминогликаны слой мочевого пузыря, что позволяет опухолевые клетки для имплантации. Методы , используемые включают электрокоагуляции, что приводит к одной точке повреждения в стенке мочевого пузыря, что приводит к развитию опухоли на одном участке в мочевом пузыре 1,2. Тем не менее, вероятность успеха имплантации опухоли с использованием электрокоагуляции является функция зависит от оператора колеблется от 10 – 90%, и она включает в себя опасность, что стенка мочевого пузыря будет пробита, что приводит к развитию опухолей, развивающихся в брюшной полости. Химическое прижигание осуществляется с использованием нитрата серебра, который повреждает мочевой пузырь стенки 3. Аналогичным образом , кислота использовалась , чтобы привести к повреждению стенки мочевого пузыря 4. Трипсин был также использован , чтобы повредить мочевой пузырь а также 5. Эти методы могут привести к развитию более чем одной опухолью в мочевом пузыре.Кроме того, существует опасность серьезного повреждения мочевого пузыря, если химические вещества остаются в контакте со стенкой мочевого пузыря слишком долго. Метод , разработанный Ninalga и др. использует положительно заряженный поли-L-лизин (PLL) 6 молекул обволакивать стенки мочевого пузыря; Это позволяет отрицательно заряженные опухолевые клетки, чтобы прилипнуть к гликозаминогликанов слоя мочевого пузыря. Этот метод обычно приводит к более чем одной опухолью , развивающейся в мочевом пузыре, но имплантации опухоли на 80 – 100% 4,7. С технической точки зрения это также самый простой процедуры для выполнения. Для того, чтобы гарантировать, что опухоли, которые развиваются достаточно даже по размеру, важно, что опухолевые клетки не группируются в крупных комков перед имплантацией.
Для оценки терапевтической эффективности, то лучше всего выполнить это исследование на мышах с довольно аналогичного размера опухолей. Таким образом, хорошая система обнаружения, которая может количественно оценить размер опухоли вскоре после имплантации имеет важное значение. Существует несколько стратегий имеют пчелыN используется для оценки опухоли. Они включают в себя магнитно – резонансной томографии (МРТ) 8-10, флуоресценцию 11, биолюминесценции 12,13, ультразвук 14 и иммуноферментного анализа (ИФА) 15,16. В то время как МРТ и УЗИ не требуют модификации опухолевых клеток, существует необходимость в чувствительной аппаратуры и контрастных агентов для МРТ. В флуоресцентные-,-люминесцентных и ELISA-анализы, основанные требуют модификации опухолевых клеток, чтобы выразить маркерные белки, которые могут быть обнаружены с помощью этих методов. Для люминесценции, подложка необходима для обнаружения активности люциферазы; Таким образом, есть дополнительный шаг, и увеличение стоимости. Оба люминесценции и флуоресценции требуют специального оборудования. Для получения флуоресценции, зеленый флуоресцентный белок (GFP), циклизации, которая катализирует молекулярным кислородом, требуется. Таким образом, выражение GFP может быть переменной в пределах массы опухоли в зависимости от доступа кислорода, что делает это довольно ненадежным маркером <sup> 17. Модификация мышиной линии клеток рака мочевого пузыря MB49 секретируют человеческого простат – специфического антигена (ПСА) 15,16 в качестве суррогатного маркера является другая стратегия. Эти маркеры также обеспечивают альтернативные средства, подтверждающие наличие опухоли при завершении эксперимента, что делает их альтернативу иммуногистохимии. Это исследование сообщает метод ФАПЧ имплантации ортотопической опухоли и представляет сравнение систем обнаружения опухолей, а именно ELISA, флуоресценция, и ультразвуковой визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в протоколе: 1) успешно поддерживая туморогенности клеточной линии; 2) обеспечение секреции измеримое ПСА до имплантации опухолевых клеток у мышей; 3) получение суспензии одноклеточных для имплантации так, чтобы уменьшить изменение размера опухоли; и 4) прививать кл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O’Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette–Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O’Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
