Het activeren van Autofagie door Aerobic Oefening in Muizen
Summary
Autofagie activatie is gunstig bij de preventie van een aantal ziekten. Een van de fysiologische technieken induceren autofagie in vivo lichaamsbeweging. Hier laten we zien hoe autofagie activeren door aërobe oefening en meet autofagie niveaus in muizen.
Abstract
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Introduction
Autofagie is een evolutionair geconserveerd afbraakroute, die wordt geïnduceerd in reactie op verschillende stress-aandoeningen zoals honger en hypoxie 1, 2. Tijdens autofagie, dubbel membraan blaasjes, genaamd autofagosomen, nemen onnodige of beschadigde subcellulaire componenten en vervoeren ze in lysosomen voor degradatie 3. Basale autofagie is essentieel voor cellulaire functie en organisme ontwikkeling en verminderde basale autofagie is betrokken bij vele stoornissen, waaronder neurodegeneratie, tumorigenese en type 2 diabetes 4, 5, 6.
De bekendste fysiologische autofagie inducer is de honger. Het heeft echter twee belangrijke beperkingen. Ten eerste, verhongering duurt een lange periode om autofagie effectief te veroorzaken bij dieren, bijvoorbeeld, 48 uur van voedsel beperking in muizenIn de meeste organen. Ten tweede, verhongering nauwelijks induceert hersenen autofagie, als gevolg van een relatief stabiele toevoer van voedingsstoffen in de hersenen. In feite is het ook moeilijk om autofagie detecteren van kleine moleculen inductoren, zoals veel geneesmiddelen de bloed-hersenbarrière niet kan passeren. Dus, om beter de functie van autofagie activering in pathogenese analyseren we onlangs ontdekt dat de oefening is een meer potente fysiologische methode autofagie induceren in een korte tijd 7, 8, 9. Vergeleken met hongersnood, wordt autofagie effectief geïnduceerd door loopband lopen zo snel als 30 min. Aldus oefening is een gemakkelijke en krachtige fysiologische benadering om het mechanisme van autofagie bestuderen mediëren gezondheidsvoordelen en voorkomen van ziekten.
Er zijn verschillende eiwit markers voor de detectie van autofagie activiteit, waaronder LC3 en p62. LC3 (microtubule-geassocieerde eiwit 1A / 1B-light chain 3) is een cytosolisch eiwit (LC3-I te vormen) dat is geconjugeerd aan PE (fosfatidylethanolamine) bij autofagie. PE-gelipideerde LC3 (LC3-II vorm) wordt gerekruteerd op autophagosomal membranen en kan worden gebruikt om autofagosomen zichtbaar wordt bij gelabeld met GFP. De translocatie van het cytoplasma naar structuren van autofagosomen punctata onder microscopie is een indicatie van autofagie. p62 is een lading receptor voor autofagie substraten (zoals ubiquitinatie eiwitten), en is opgenomen in autofagosomen ook. Omdat het eiwit wordt afgebroken in lysosomen met autofagosomen, kan het niveau worden gebruikt om de flux te meten autofagie. Hier laten we zien hoe deze markers te gebruiken om autofagie te kwantificeren in verschillende muis weefsels veroorzaakt door aërobe oefening, met inbegrip van gedwongen oefening (loopband) en vrijwillige inspanning (loopwielen). Dezelfde werkwijzen kunnen ook worden toegepast op in vivo meten van autofagie na behandeling van andere induceerders.
Protocol
Representative Results
Discussion
Autofagie is een katabool proces dat energie levert en vermindert cytotoxiciteit door lysosomale afbraak van cytoplasma onderdelen of beschadigde organellen. Bestuderen autofagie belangrijk voor de regulatie van cellulaire homeostase en de mechanismen van stress respons begrijpen. Nieuwe modellen en methodieken zijn in opkomst op het gebied van onderzoek 15, om te bestuderen hoe verstoorde autofagie bijdraagt aan tal van pathologische processen 16, <sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Materials
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
