Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi

Summary

attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.

Abstract

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Introduction

Autofagia è un percorso di degradazione evolutivamente conservato, che viene indotta in risposta a varie condizioni di stress come la fame e ipossia ^{1, 2.} Durante l'autofagia, vescicole a doppia membrana, chiamato autofagosomi, incorporano componenti subcellulari inutili o danneggiati e trasportarli nei lisosomi per la degradazione ^3. Autofagia basale è essenziale per la funzione cellulare e lo sviluppo dell'organismo, e alterata autofagia basale è implicato in molti disturbi, tra cui neurodegenerazione, tumorigenesi e diabete di tipo 2 ^{4, 5, 6.}

Il più noto autofagia induttore fisiologico è fame. Tuttavia, ha due limitazioni principali. In primo luogo, la fame richiede un lungo periodo di indurre l'autofagia in modo efficace negli animali, ad esempio, 48 ore di restrizione alimentare nei topinella maggior parte degli organi. In secondo luogo, la fame induce a malapena autofagia cervello, a causa di un apporto di sostanze nutritive relativamente stabile nel cervello. In realtà, è anche difficile da rilevare induzione autofagia dagli induttori di piccole molecole, come molti farmaci non possono passare la barriera emato-encefalica. Così, per analizzare meglio la funzione di attivazione dell'autofagia nella patogenesi della malattia, abbiamo recentemente scoperto che l'esercizio fisico è più potente metodo fisiologico per indurre autofagia in un breve periodo di tempo ^{7, 8, 9.} Rispetto fame, autofagia è effettivamente indotta da tapis roulant in esecuzione veloce come 30 min. Pertanto, l'esercizio fisico è un approccio fisiologico comodo e potente per studiare il meccanismo di autofagia nel mediare benefici per la salute e la prevenzione delle malattie.

Ci sono diversi marcatori proteici per la rilevazione di attività autofagia, tra cui LC3 e P62. LC3 (associata ai microtubuli proteina 1A / 1B-luce cHain 3) è una proteina citoplasmatica (LC3-formo) che viene coniugato con PE (fosfatidiletanolamina) su induzione autofagia. LC3 PE-lipidated (modulo LC3-II) viene reclutato su membrane autophagosomal e può essere utilizzato per visualizzare autophagosomes quando etichettati con GFP. La sua traslocazione dal citosol puntata strutture di autophagosomes al microscopio è un'indicazione di induzione autofagia. p62 è un recettore di carico per supporti autofagia (come proteine ​​ubiquitinazione), ed è incorporato autophagosomes pure. Poiché la proteina è degradata in lisosomi insieme autophagosomes, i suoi livelli possono essere usati per misurare il flusso autofagia. Qui mostriamo come utilizzare questi marcatori di quantificare l'autofagia in diversi tessuti di topo indotte da esercizio aerobico, compreso l'esercizio forzato (tapis roulant) e esercizio volontario (in esecuzione ruote). Le stesse procedure possono essere applicate anche alla misurazione in vivo dell'autofagia dopo il trattamento di altri induttori.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Northwestern University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). 1. modelli murini Utilizzare 8-12 settimane di età topi nella formazione esercizio. Per rilevare l'autofagia esercitato indotta in vivo, utilizzare il topi transgenici GFP-LC3 (C57BL / 6 di fondo) per studi di imaging e C57BL / 6 topi per le analisi biochimiche. 2. L'au…

Representative Results

Questo protocollo descrive due diversi metodi per indurre l'autofagia nei tessuti di topo di esercizio aerobico: un totale di 90 minuti di esercizio fisico forzato su un tapis roulant a più corsie preceduto da due giorni di acclimatazione; o due settimane di esercizio volontario su una ruota in esecuzione usato dai topi alloggiati individualmente. In ogni protocollo di esercizio, siamo in grado di misurare il flusso autofagia da microscopia a fluorescenza e l'analisi Western Blo…

Discussion

Autofagia è un processo catabolico che fornisce energia e riduce citotossicità dalla degradazione lisosomiale di anticitoplasma o organelli danneggiati. Studiare l'autofagia è importante capire la regolazione dell'omeostasi cellulare e meccanismi di risposta allo stress. Nuovi modelli e metodologie stanno emergendo nel campo della ricerca ^15, per studiare come alterata autofagia contribuisce a numerosi processi patologici ^{16, 17.</su…}

Materials

Treadmill	Columbus Instruments	150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel	Super Pet	100079365	diameter 11.4 cm
Odometer	Bell	DASHBOARD 100
Syringe pump	KD Scientific	KDS100
Fluorescence microscope	Nikon	Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat	Leica	CM 1850UV
Homogenizer	IKA	003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine	CAYMAN CHEMICAL COMPANY	14194
Parafolmaldehye	SIGMA-ALDRICH	P6148	Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer
Mounting media	Vector Laboratories	H-1200
p62 antibody	BD Biosciences	610833
LC3 antibody	Novus Biologicals	NB100-2220
2X Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0737
ImageJ	NIH