Autophagy aktivering är fördelaktigt vid förebyggande av ett antal sjukdomar. En av de fysiologiska metoder för att inducera autophagy in vivo är fysisk träning. Här visar vi hur du aktiverar autophagy av aerob träning och mäta autophagy nivåer i möss.
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Autophagy är en evolutionärt konserverad nedbrytningsväg, som induceras som svar på olika stressförhållanden, såsom svält och hypoxi 1, 2. Under autophagy, dubbel membranvesiklar, som kallas autophagosomes, införliva onödiga eller skadade subcellulära komponenter och transportera dem till lysosomer för nedbrytning 3. Basal autophagy är avgörande för cellulär funktion och organismutveckling, och försämrad basal autophagy är inblandade i många störningar, inklusive neurodegenerering, tumörgenes och typ 2-diabetes 4, 5, 6.
Den mest kända fysiologiska autophagy induceraren är svält. Det har dock två stora begränsningar. Först tar svält en lång tid för att effektivt inducera autophagy i djur, t.ex. 48 timmar av mat begränsning hos mössi de flesta organ. För det andra, svält inducerar knappt hjärn autophagy, på grund av en relativt stabil näringstillförsel i hjärnan. I själva verket är det också svårt att detektera autophagy induktion genom småmolekylära inducerare, eftersom många läkemedel inte kan passera blod-hjärnbarriären. Således, för att bättre analysera funktionen av autophagy aktivering i sjukdoms patogenes, upptäckte vi nyligen att motion är en mer potent fysiologisk metod för att inducera autophagy i en kort tidsperiod 7, 8, 9. Jämfört med svält, är autophagy effektivt induceras av treadmill att köra så fort som 30 min. Således, är motion ett bekvämt och potent fysiologisk metod för att studera mekanismen för autophagy i medla hälsofördelar och förebygga sjukdomar.
Det finns flera proteinmarkörer för påvisande av autophagy-aktivitet, inklusive LC3 och p62. LC3 (mikrotubuli-associerat protein 1A / 1B-ljus chain 3) är ett cytosoliskt protein (LC3-I bildar) som är konjugerad till PE (fosfatidyletanolamin) på autophagy induktion. PE-lipiderade LC3 (LC3-II form) rekryteras på autophagosomal membran och kan användas för att visualisera autophagosomes när märkt med GFP. Dess translokation från cytosolen till punktat konstruktioner av autophagosomes enligt mikroskopi är en indikation på autophagy induktion. p62 är en last receptor för Autophagy substrat (t.ex. ubikitinering proteiner), och inkorporeras i autophagosomes också. Eftersom proteinet bryts ned i lysosomer tillsammans med autophagosomes, kan dess nivåer användas för att mäta den autophagy flux. Här visar vi hur man använder dessa markörer för att kvantifiera autophagy i olika mus vävnader induceras av aerob träning, inbegripet tvångs övning (treadmill) och frivillig träning (löphjul). Samma förfaranden kan också tillämpas på in vivo mätning av autophagy efter behandling av andra inducerare.
Autophagy är en katabolisk process som ger energi och minskar cytotoxicitet genom lysosomal nedbrytning av cytoplasma komponenter eller skadade organeller. Studerar autophagy är viktigt att förstå regleringen av cellulär homeostas och mekanismerna för stressrespons. Nya modeller och metoder växer fram inom forskningsområdet 15, för att studera hur nedsatt autophagy bidrar till många patologiska processer 16, 17.
<p class="jo…The authors have nothing to disclose.
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
ImageJ | NIH |