我々は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの読み出しを用いてタンパク質相互作用をアッセイするための自動化された蛍光寿命イメージング(FLIM)を利用するオープンソースの高含有量分析(HCA)装置を提示します。このopenFLIM-HCAの楽器のためのデータ取得がマイクロマネージャーとデータ分析で書かれたソフトウェアによって制御されFLIMfitで行われています。
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
アッセイ化合物ライブラリーへの薬物の発見1で自動化された高含有量分析(HCA)の使用の増加は、siRNAライブラリーの表現型スクリーン用の系統的な研究、 例えば 、のための自動化された画像化実験に向けた生命科学基礎研究の動向によって補完されます。自動化されたHCAはまた、典型的には、従来の顕微鏡で画像化した細胞の料理の数十と手動の実験で実施されてきた小規模な生物学的研究のためにますます重要になってきています。視野数百〜数千をアッセイし、分析する能力によって付与される統計的検出力は、オペレータバイアスを排除し、しばしば助けることができる画像データ取得と大量のサンプルアレイの分析の自動化(「生物学的ノイズ」を含む)は、実験ノイズの平均化を可能にしますこのような収集中IRFのプロファイルの変化として系統誤差の発生を検出するために利用することができます。蛍光ベースのアッセイ広く市販されているほとんどのHCA計装相対的分布と標識されたタンパク質の共局在をマッピングするために、1つ以上のスペクトルチャネルに蛍光強度イメージングをフィーチャーして、HCAに実装されています。それらは、タンパク質相互作用、例えば 、強力な定量的な読み出しを、提供しているが、このような蛍光寿命イメージング(FLIM)、偏光異方性画像と時間分解蛍光異方性イメージングなど、より洗練された蛍光イメージングモダリティは、広く市販HCA機器に利用されません。ここでは、HCAのための自動顕微鏡でFLIMを実装するオープンソースのアプローチを提示します。
蛍光寿命は、励起/検出効率、およびscatteの影響により、異なる分子種を区別するため、またはフルオロフォアの局所分子環境を探索するために使用することができ、本質的に比例分光読み出しを提供し、フルオロフォアの濃度に非感受性でありますリングとサンプル吸収2。蛍光寿命測定は、単一のスペクトル・チャネルにすることができるのでさらに、彼らは、キャリブレーションなしで異なる機器とサンプルとの間の直接比較です。これらは、生物学的プロセス及び病態の本質的な読み出しを提供するために、いくつかの細胞代謝産物、脂質、および細胞外マトリックス成分を含む内因性蛍光団に適用することができます。こうしてラベルフリーFLIMセル3,4内の代謝変化をマッピングすることができ、幹細胞の分化5,6およびコラーゲン足場7の成長を監視するために適用されています。我々は最近、FLIM HCAは、自己蛍光8を利用して細胞代謝の自動ラベルフリーアッセイに使用することができることを実証しました。しかし、より一般的には、蛍光寿命測定及びFLIMはしばしばantibodieに結合された色素を使用して、細胞コンパートメントを染色する色素を使用して実装、特定の生体分子を標識する外因性蛍光団に適用されます特定のタンパク質に結合された遺伝的に発現し、フルオロフォアを使用して固定された細胞内の特定のタンパク質を標的、またはs。蛍光寿命は、その物理的または化学的環境を感知する蛍光プローブの強固な定量的読み出しを提供するために使用することができます。例については、染料は、細胞膜9または細胞粘度10の局所脂質相を感知するために配備されており、遺伝的に発現した蛍光タンパク質ベースのバイオセンサーはIP3 11、PIP2 12およびカルパイン13として含むまたはシグナル伝達分子の細胞濃度を報告するために開発されています例えば、カルシウム14,15、カリウム16と塩化17とイオン。
多くのこのようなバイオセンサは、バイオセンサの配座の変化の読み出しを提供するために、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)18,19を利用します 。 「ドナー」および「アクセプター」フルオロフォア間のFRETが近距離直接双極子 – 双極子相互作用を介して起こりますそのためにフルオロフォアは、典型的には約10ナノメートル未満で分離されています。したがってFRETの検出は、適切に標識されたタンパク質の近接を示し、したがって、結合またはオリゴマーなどのタンパク質-タンパク質相互作用20を読み出すための手段を提供する-のいずれかの生の経時変化の測定で固定された細胞又は動的イベントにおけるエンドポイントとして細胞。または切断- -ドナーおよびアクセプターフルオロフォアの両方を有する適切な分子構築物を標識することにより、そのコンフォメーション変化を読み出すことも可能であるFRETの変化を介して、構築物、これは、多くのバイオセンサ21の基礎です。 FRET効率の測定は、ドナー – アクセプター距離とFRETを受けたドナーフルオロフォアの人口割合に関する情報を提供することができます。したがって、FRETベースのイメージング技術は、細胞シグナル伝達は、22を処理し解明するために、例えば 、空間及び時間における分子相互作用をマッピングし、定量するために使用することができます。オートマットるこのようなイメージング技術は、経路またはシグナル伝達ネットワークの読み出しに基づいて、ハイスループットアッセイを提供することができます。
HCAでは、最も一般的に実装されたFRET読み出しは、ドナー強度に対する受容体の比率の変化がマッピングされているスペクトルのレシオメトリックイメージング、です。このアプローチは容易に実装されているが-と多くの市販のマルチウェルプレートリーダーで利用可能です-定量的スペクトル分解FRET測定は、システム23のスペクトル応答のキャリブレーションを必要とします。これは、スペクトルアクセプターのブリードスルーと直接励起だけでなく、機器およびサンプル(インナーフィルター効果)の伝送特性に起因するスペクトルのクロストークが含まれています。原則的に、これは、いずれかのドナーのみまたはアクセプタのみで標識されている追加の「コントロール」サンプルの測定を伴います。
このようなスペクトルレシオメトリックFRET測定から、 効果的なFRET効率(実際のFRET効率とFRETingドナー/アクセプター分子の画分の生成物)は、ドナーとアクセプター分子24の相対的な割合と共に得ることができます。スペクトルレシオメトリックFRETは、しばしば、ドナー/アクセプターの化学量論は、既知であると仮定することができる単分子FRETバイオセンサーと共に使用されます。用量応答曲線を得るために、 例えば 、FRETingドナーおよびアクセプターの集団の画分を決定するために、実際のFRET効率の知識が必要とされます。これは、既知の特性を有する正のFRETの対照試料を測定することによって、またはそのような受容退色またはFLIMように、FRET効率を測定するための別の方法を使用することによって得ることができます。
蛍光寿命の読み出しを使用して、FRETが検出され、単独のドナー発光の測定によって定量化することができる – スペクトル較正さらに対照試料の必要性を除去します。したがって、FLIM FRETの読み出しは、機器間で比較することができます異なるサンプル間-ライブ疾患モデルの内視鏡検査またはトモグラフィー25からのデータは、細胞ベースのアッセイの測定に対してベンチマークすることを可能にします。 FRETing非FRETingドナー集団、FRET効率および集団の画分に応じた適切な多指数減衰モデルにドナー蛍光の減衰プロファイルを適合させることによって、原理的には、さらなる測定することなく直接得ることができます。これらの重要な利点は、しかし、スペクトル分解強度イメージングよりピクセルあたりより多く検出された光子を必要とFLIMのコストで来る – 通常、光子の数百人は、単一指数減衰モデルとするときにフィットする際に10%の生涯決意の精度を達成するために必要とされます複雑な(多指数減衰)モデルへのフィッティング蛍光減衰プロファイルは、検出された光子の数は数千人に増加を必要としました。これは、従来のviのフィールド当たりの秒の数百に長い取得時間(数十につながっていますEW)FLIMのために、時間を用いて、特にときにレーザ走査型顕微鏡で順次画素獲得で実装単一光子計数(TCSPC)の相関。より高い励起強度を用いて画像形成速度を増加させる試みは、有意な光退色および/または毒性をもたらすことができます。一緒に適切な商業的に利用可能な機器やソフトウェアツールの欠如で、これは、創薬や数百ビューのフィールドの数千には、撮像されるべきであるシステム生物学のためのHCAで利用されることからFLIMを妨げてきました。レーザ走査TCSPC FLIMは、それが共有するレシオメトリックイメージング28のスペクトルと同様、撮像速度に到達することができ、定常状態の偏光分解蛍光異方性画像27で「ヒット」の識別に続く第二の測定のための自動化されたマルチウェルプレート、顕微鏡26に実装されています多くの利点と欠点。蛍光異方性の画像化は、減少を利用しますFRETの存在下でのアクセプターの蛍光異方性でもクロストーク(アクセプターの例えば、直接励起)スペクトルに敏感です。これは、偏光クロストークを考慮してキャリブレーションを必要としFRET効率の直接測定を提供していません。
HCAのためのFLIMの利点を実現するために、我々は、画像取得のスピードと技術へのより広いアクセスの問題に対処するために取り組んできました。ここでは、模範FRETベースのアッセイと一緒に、以下に記載されている自動化された迅速なFLIMマルチウェルプレートリーダーを実装するために利用することができるオープンソースのソフトウェアとハードウェアコンポーネントの完全なリストを提供します。我々のアプローチ29では、FLIMは起因するシングルビーム走査TCSPCより速いイメージング速度及び低い光退色を提供することができ、図1に示されているゲーティング光学イメージインテンシファイア(GOI)を用いて広視野時間依存性画像化を使用して実現されています並列ピクセルINTERRogation。私たちのopenFLIM-HCAの機器は、(サンプルの明るさに応じて)ピクセルあたり数百の光子を検出FLIMデータを取得するだけで数秒を必要とする、教師なしFLIMを提供することができます。 、ビューの前のフィールドからのサンプルを移動するために、取得の設定を調整し、焦点に試料を維持するのに必要な時間と組み合わせて、これは、典型的には、図25,28の視野あたり〜10秒のマルチウェルプレートの捕捉時間をもたらします。光学的切片は、準広視野ニプコー(「回転ディスク」)スキャナ30を使用して実施することができます。
FLIMデータ分析のために、我々は急速に従来のPCワークステーション上のマルチウェルプレートのFLIMデータセットを分析することができ、プラグインOMERO 32のためであるFLIMfit 31と呼ばれるオープンソースのソフトウェアツールを開発しました。 FLIMfitは Oで複雑なモデルに適合させるためにFLIMデータを有効にする(1.2節で説明)グローバル解析機能を提供しますしたがって、必要な検出された光子の数、サンプル画像取得時間の光曝露を低減する、蛍光寿命成分が画像または関心領域(ROI)を横切って不変であると仮定して画素当たり数100の光子をNLY。標準的なデスクトップPC上でFLIMfitを実行している、のFOVの数百人を含むデータセットを分析するために計算時間の秒だけ10秒を必要とします。したがって、FLIMデータ収集と分析の両方は、HCAのための実用的な時間スケールで行うことができます。
openFLIM-HCAのハードウェア
FLIMのHCAの当社の実装では、6つの主要なコンポーネントを含む:(ⅰ)光学オートフォーカス機能付き蛍光顕微鏡のフレームと、 (ⅱ)電動(XYZ)顕微鏡ステージ。 (iii)の励起用レーザ光源。 (iv)のゲート付き光学増圧器(GOI)、遅延発生器とカメラと広視野時間ゲートFLIMシステム。 (V)データ収集及び分析および(VI)ニポウディスクスキャナ用コンピュータ光学的切片イメージングのためのユニットは、フォーカスライトの外に抑制することができます。カバースリップまたは培養培地から細胞質の蛍光または背景からの寄与によって圧倒され得る細胞原形質膜におけるFRETバイオセンサーから、 例えば、弱い信号を撮像する際に重要であり得ます。時間ゲートFLIMデータは、超短パルス励起放射線で試料を照射GOIの光電陰極に蛍光発光を撮像し、時間遅延の設定範囲のGOIの蛍光体のCCDの一連の画像を取得することによって取得されます励起パルスの到着後の光増倍ゲート。励起後の時間ゲート遅延が増加するにつれて、蛍光シグナルが減少するように見られ、CCDで取得された時間ゲート蛍光強度の一連の画像は、視野内のすべてのフルオロフォアの減衰プロファイルを分析するために必要なデータセットを形成します。 GOIのゲーティングは、励起パルスに同期されますそして、CCDの取得の一連のため、励起パルスの時間ゲートの相対的な遅延は、所望の範囲にわたって値を増加させる一連に設定されています。この同期は「高速遅延ボックス」(1ピコ秒刻みで20ナノ秒に遅延を提供する)と、25ピコ秒の最小ステップで遅延を提供する「粗遅延ボックス」を含む遅延発生器を使用して達成されます。
FLIMのために、励起は任意の超高速レーザーによって提供することができます。便宜のために、我々は、典型的には、適切な励起放射線が異なるバンドパスフィルタを用いて電動フィルタホイールを使用して、任意のフルオロフォアのために選択することが可能な可視スペクトルにわたってピコ秒パルスの可変を提供するファイバレーザ励起スーパコンティニューム光源を使用します。一般的に、我々は40または60 MHzの繰り返し率でパルスをサンプルで〜100-200μWの平均電力を使用します。このような励起パワーはまた、周波数倍増に基づいて、超高速レーザ源によって提供することができますモードロックチタンドープサファイアレーザー。 〜100 psの下の励起パルスの持続時間は、ほとんどの実験のために十分であることに注意してください。中性密度フィルターを備えた第二電動フィルタホイールは、励起強度を調節するために使用されます。安全性と利便性のために、励起放射線は、シングルモード光ファイバを介して送達されてもよいです。広視野FLIMおよび光学切片FLIMのための構成は、それぞれ図2及び3に示されています。使用される正確なコンポーネントの詳細については、openFLIM-HCAのwiki 33を参照してください。現在のパーツリストのコピーは、補足資料に記載されています。
広視野FLIMのため、励起放射線はできるだけ均一に全視野を照明するために必要とされます。このために我々はDIFの面で、時間平均に10から50 Hzでレーザースペックルを回転させて、ホログラフィック「トップハット」の拡散に励起レーザビームを向けます定着器は、顕微鏡対物レンズの後焦点面に結像されます。顕微鏡の出力ポートからの蛍光像を冷却科学CCD(チップサイズ10.2ミリメートル×8.3 mm)で、センサ上に結像されるGOIの光電陰極と、GOI(活性領域の対角線18 mm)での蛍光体の上に中継されます0.7の倍率を提供するカメラレンズのペアを使用して、カメラ。システムは、RS232プロトコルを使用して計測器にインターフェースされている標準的なPCによって制御されます。また、Arduinoのマイクロプロセッサは、CCDカメラはFLIMデータを取得し、スペクトル的にフィルタリングさスーパーコンティニュームの平均電力を測定するために使用されるフォトダイオードからの信号を記録する場合を除いて閉鎖される励起光路中にシャッターを制御するために使用され励起源。光学切片化FLIMは、励起レーザ放射は、Sとして、ニポウディスクスキャナユニットに直接接続され、シングルモード偏波保持光ファイバに結合されています図3にhown。ニプコースキャナ部から出力蛍光画像は、GOIの光電陰極上に中継され、システムの残りの部分は、広視野FLIMの場合と同じです。
openFLIM-HCAソフトウェア
データ収集ソフトウェアは、 マイクロマネージャー 34に書き込まれます。これは、自動的に測定中の焦点を維持し、励起および発光フィルターホイールおよびダイクロイックチェンジャを制御するために、任意のFOVのタイムコースを取得するために、プレートのウェルを画像化される順序を変更するオプションを含む完全HCAデータ取得機能を提供します自動化された多色画像化のために。強度に基づいて、 例えば 、自動的に基準に従って後続のFLIMの取得に適しのFOVの位置を特定し、記録するために、蛍光強度の「プレスキャン」取得を実行することも可能です。 FLIM HCAデータはシリーズとして保存することができますTIFFファイルの、OME-TIFFファイル( すなわち 、FOVあたり1)のシリーズとして、またはマルチウェルプレートから全てのデータを組み込んで、単一のOME-TIFFファイルとして。さらに詳しい情報やマイクロマネージャーソフトウェアの詳細な説明はopenFLIM-HCAのwiki 33で見つけることができます。
データ解析ソフトウェアは、OMERO画像データ管理プラットフォーム32のために、オープンソースMATLABベースのクライアントを31 FLIMfit、 図4に示すように、OMEROサーバから、またはコンピュータディスクからFLIMデータを読み取ることができます。 TCSPCまたは広視野時間ゲートFLIM機器からのデータを分析するために設計されており、減衰プロファイルを単一指数するフィッティングを含むopenFLIM-HCAからのデータに合うように多くの機能を提供し、このようなモデルを含む指数と高い複雑減衰プロファイルを、倍増するされました偏光分解蛍光減衰プロファイル。また、固定し、時間的に変化するバックグラウンド信号を考慮することができ、UTIができます平安大町測定時空計器応答関数(IRF)またはタイムシフトフル実験IRF測定から決定された量によって、画素毎の基準であってもよいという理想化されたIRFを使用し合うことができます。 IRFと蛍光試料の間でグローバル時間差(T 0)は 、蛍光標準の測定値から決定することができます。バックグラウンドシグナル及びIRFの空間的変動も考慮に入れることができます。 FLIMfitはピクセル単位ベースでFLIMデータを適合させることができるか、複雑な減衰モデルに控えめな(数百)の光子数とFLIMデータのフィッティングを容易にするために、「 グローバルビニング 」または「 グローバルフィッティング"を使用して。
グローバル・ビニングは、複雑な減衰モデルへフィッティング可能にするのに十分な光子数を提供するために、各時点で、ユーザ定義のROI内のピクセルのすべての検出された光子を集約することを伴います。 ROIは、視野全体(FOV)をすることができ、それがd手動ですることができますユーザによってefined、または、画像のセグメンテーションツールを使用して決定することができます。 ROIは、他の画像分割ソフトウェアからFLIMfitにインポートマスクを使用して定義することができます。 FRETの用途では、FRETingとROIにわたって空間的に不変であると仮定され、その後に再適合するために、非FRETingドナー発蛍光団に対応する蛍光寿命の成分を決定するために、二重指数減衰モデルに適合するように、グローバルビニングを使用するのが一般的です各画素におけるFRETingドナー集団の画分を得るために固定され、これらの寿命成分バレスの画素毎の基礎。
グローバルフィッティングは、同時にマルチウェルプレートの実験または蛍光寿命画像の時系列から、 例えば 、寿命部品全体FOV-間または複数のFOVを含むことができるFLIMデータセット全体画素単位FRETingドナー集団の画分をフィッティング伴います。グローバルフィッティングは、空間variatiを利用することができ、かなり多くの計算35のコストではあるが- 、したがって、より信頼性の高い結果-部品の寿命推定に強い制約を提供する世界的なビニングアプローチで失われた画像全体の人口の分画の上。 FLIMfitは急速にだけ32秒を必要とする、例えば、と従来のPCワークステーション上のグローバルフィッティングで394 FOVのそれぞれについて、5つの時間ゲートをそれぞれ含む672×512ピクセルで取得したマルチウェル時間ゲートFLIMデータセットを、マルチウェルプレートのFLIMデータセットを分析することができます二重指数関数的減衰モデル31に適合するようにメモリの2ギガバイトこれは、マルチコアプロセッサとFLIMfitコードに効果的なスケーリングを可能にするために、マルチスレッド並列アルゴリズムを使用して実装分離非線形最小二乗フィッティングアルゴリズムは、メモリ使用量を最小限に抑えるために最適化されている利用することによって達成されました。 図5は FLIMfitのグラフィカル・ユーザ・インタフェースのスナップショットを示していますおよび詳細については、グローバルなフィッティングとグローバルビニングの詳細については、参照31で見つけることができます参照36に与えられたウェブページで見ることができます。
我々のopenFLIM-HCA計測およびソフトウェアを使用してFLIMのHCAのための以下のプロトコールは、FLIMの読み出しと細胞イメージング実験の広い範囲に適合させることができます。一般に、マルチウェルプレートは、実験が検討された条件に加えて、正および負の生物学的コントロールの複製ウェルを含むように設計されるべきであるFRET。ここでは、光学的に区分さFLIMを実行するための具体的な実装について説明FRETは、短いペプチドリンカーによって連結されたmTurquoise蛍光タンパク質と金星の蛍光タンパク質からなる構築物を発現するCos細胞の( 図3を参照)。ここでmTq32V、mTq17VとmTq5V FRETは(代表的な結果のセクションで説明)を構築する構築一緒に非FRETing mTq5Aで、低、中、高のFRET効率を提供します。これらの構築物と、このプロトコルに従うために必要な他の材料は、物質一覧に記載されています。
我々は、時間ゲートFLIMを用いてHCAために設計された自動化されたマルチウェルプレート、顕微鏡を記載しています。この機器はOMEROサーバーにデータを保存するオプションとFLIMfit 36、MATLABで書かれたオープンソースのプログラムを使用して行われてFLIMデータ分析とマイクロマネージャーで書かれたオープンソースのソフトウェアを使用して制御し、OMEROクライアントとして利用可能な32 マイクロマネージャー楽器れます制御ソフトウェア、openFLIM-HCAは 、自分のFLIMのHCAの楽器を構築するために学術研究者を有効にするには、システムコンポーネント48のリストと33オンラインで入手できます。
ロバストFLIMデータを取得するためには、GOIとCCD取得設定を最適化し、T 0における任意の変化を考慮する必要があります。 3.8.2で説明したように、GOIゲイン設定とCCDカメラの積分時間〜CCDのダイナミックレンジの75%に達するように設定されるべきです。 U各時点でゲート遅延が対雑音比49に信号を増加させるが、これは、より少ない蛍光光子をCCDカメラが飽和する前に、フレームごとに取得しているため、合計FLIM取得時間(とようにフレームの蓄積の数を増加させ、より高いGOI電圧および複数のCCDフレームの蓄積を歌います増加させるべきである)ので、このトレードオフは、各実験のために決定されるべきです。遅延発生器の較正は、レーザ繰り返し率に依存し、使用される繰り返し率の正しい較正ファイルを取得ソフトウェアにロードされていることを確認する必要があります。遅延ボックスを較正するための手順はopenFLIM-HCAのwiki 33で見つけることができます。
細胞の自己蛍光は、蛍光シグナルと比較して低い場合、我々は、時間的に変化するバックグラウンド(TVB)を提供するために十分に含むだけ培地からの信号を使用します。細胞培養培地からのバックグラウンド蛍光を最小化するために、我々は避けますフェノールレッドを含む培地。細胞の自己蛍光が有意である場合、TVBは、非標識細胞の測定から導出することができます。これは自家蛍光の背景が画像内の画素ごとに同じであることを前提としていたようしかし、この場合には注意が払わなければなりません。自家蛍光が細胞間または励起ビームまたは検出感度が視野にわたって均一でない場合、大幅に変化した場合、この仮定は有効になりません。
散乱励起光パルスを用いIRF画像の取得は、フィッティングプロセスでのデータモデルで畳み込まれている一時的なIRFのプロファイルを提供し、また、視野全体でIRFの空間的変化のマップを提供します。 IRFは、ニポウディスクはIRFのクリーンな測定を提供するから散乱励起光を使用して、我々の機器では、このようなコロイド懸濁液もののとして散乱試料を撮像して測定することができます。タイミングOの正確な決意複雑な指数関数的減衰モデルに当てはめる場合は特に励起と時間ゲートとの間の時間遅延の誤差が大きく、フィッティングプロセスに影響を与える可能性があるため、IRF fが重要です。 IRFは、IRFの空間的変動は、同じであるべきであるが、そのタイミングに影響を与えることができ、それは励起波長ではなく、蛍光発光波長で記録されるので、嵌合プロセスのために必要とされないまさに散乱励起光を用いて取得しました両方の波長で。光学切片化FLIMでニポウディスクから取得したIRFの場合のように加えて、散乱IRFはグローバルに起因散乱物体からの異なる光路長に真IRFに時間的にシフトされてもよいです。 Protocに示すように取得された散乱励起光IRFに適用されるべき必要なグローバル時間的なシフトでこの補正、T 0は 、次指数参照色素データから計算されますオールステップ4.4。下記の染料は、異なる励起波長のために使用することができます:メタノール中の75μMのクマリン153溶液(τ〜4.3ナノ秒50)は範囲295から442 nmの励起のために使用することができます。エタノール中75μMのクマリン6溶液(τ〜2.43ナノ秒37)範囲430から500 nmの励起のために使用することができます。水に75μMローダミンB溶液(τ〜1.7ナノ秒37)範囲488から575 nmの励起のために使用することができます。我々は、システムの各画素に対して異なるIRFを使用するFLIMfitに可能であるが、通常、空間的に変化するIRFは、画像内の画素毎に同じ時間プロファイルを有するが、範囲を示すという仮定を行うことが妥当であることに注意します空間的にグローバルトン0からの相対時間的オフセットを変化させます。私たちは、散乱光のIRFから決定されたIRFの変速マップ、としてこれを記述します。一緒に、IRFプロファイル、 時刻t 0およびIRFシフトマップには専用に使用されていますFOV内の各ピクセルは、適切なIRFが装着されていることを確認してください。それは任意のFLIMデータ収集前に測定されるべきであるので、重要なことに、T 0は、時間の経過とともに徐々に変化することができます。
ユーザーは、蛍光減衰プロファイルをサンプリングする方法を決定する必要があり、励起後の時間ゲートおよびそれらの相対的な遅延の幅を設定する必要があります。一般的には、検出信号を最大にするために、広いゲート幅を使用し、典型的には、我々は、蛍光タンパク質で標識された細胞のFLIM 4ナノ秒に設定し、ゲート幅を使用することが望ましいです。時間ゲート遅延の数は、分析に使用されるフィッティングモデルの複雑さ所与の(単に励起パルス前の信号を測定するように設定つのゲートを含む)蛍光減衰プロファイルをサンプリングするのに十分であるべきです。最適値は、寿命及び減衰成分の相対振幅に依存することができます。一般的には、4ゲートは、フィッティング単一指数のために十分である7以上のゲートがかもしれないが減衰しますより複雑な崩壊モデルに使用されます。
私たちは、FLIMは、時間領域または周波数領域技術の範囲を使用して実装することができ、マルチウェルプレートアレイの自動FLIMのHCAが最初にFRET 51の周波数ドメイン寿命の読み出しを使用して(非切片)広視野顕微鏡で実装されたことに注意してください。広視野時間ゲートイメージング28を利用HCAための最初の自動光学セクショニングFLIMマルチウェルプレートリーダーは次に、報告されました。続いて、広視野(非切片)周波数領域FLIMのHCAは、FRET 52を用いて、遺伝子ライブラリー全体の翻訳後修飾(チロシンリン酸化)をスクリーニングするために適用し、時間ゲートFLIMのHCAは、HIV-1のGagのFRETアッセイするために適用されていますオリゴマー化53およびFOXM1 54のSUMO化のとライチュウのRhoAおよびRac1のバイオセンサー33の。マルチウェルプレートFLIM 26 TCSPCを使用することも可能であるが、今日まで、それはTに一致するように挑戦的証明されています彼は広視野検出を利用した技術のスループット。この問題に対処することができ一新興のアプローチは、SPADアレイ55のような単一の光子計数検出器のアレイを使用することです。
我々は、蛍光タンパク質を用いたFRETのいずれかの読み出しは慎重にとFLIMfitから得られたパラメータまたは任意の他のFLIM解析ソフトウェアの絶対値はフィッティングモデルに関連付けられた仮定に依存することに扱われるべきであることに注意してください。 FRETドナーが重要な第2の減衰成分を有する例については、FRET FLIMデータに合わせてbiexponentialモデルの使用は、典型的には、それが必要以上FRETing集団は高い現れると関連付けられ速い減衰成分の寄与をもたらすことができます。このようなmTq2FPモノ指数寿命のドナーを使用することが望ましいです。それでも、最近の研究は、FRET分析は依然としてアクセプタ蛍光タンパク質またはによって暗い状態により影響され得ることを示しています発色団の角度と距離56の様々な蛍光体の立体構造の分布に方向係数κ2の不均一。それにもかかわらず、我々などがFRETの蛍光寿命の読み出しは、生化学的測定値と相関し、タンパク質相互作用をスクリーニングするために、又はバイオセンサのダイナミクスを追跡するために使用することができる有用な結果を生み出す行うことが示されています。したがって、このopenFLIM HCAプラットフォームは、FRETまたは細胞の自己蛍光8を利用して 、同様に染料ベースのプローブ25の定量的な読み出しを提供する蛍光寿命に基づくアッセイの広い範囲に適用することができます。
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |