Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
El uso cada vez mayor de análisis de contenido de alta automatizado (HCA) en el descubrimiento de fármacos 1 a bibliotecas de compuestos de ensayo se complementa con la tendencia en la investigación en ciencias básicas vida hacia los experimentos de imagen automatizados para estudios sistemáticos, por ejemplo, para las pantallas fenotípicas de siRNA bibliotecas. HCA automatizado también se está volviendo cada vez más importante para los estudios de menor escala biológica que normalmente se han implementado con experimentos manuales con decenas de placas de células fotografiados con los microscopios convencionales. La potencia estadística que confiere la capacidad de ensayar y analizar cientos de miles de campos de visión permite un promedio de ruido experimental (incluyendo el "ruido biológica") y la automatización de adquisición y análisis de grandes conjuntos de muestras de datos de imagen puede ayudar a eliminar la influencia del operador y, a menudo se pueden utilizar para detectar la aparición de errores sistemáticos, tales como un cambio en el perfil IRF durante una adquisición. ensayos basados en fluorescenciason ampliamente implementado en HCA, con más comercialmente disponible instrumentación HCA con imágenes la intensidad de fluorescencia en uno o más canales espectrales para mapear la distribución relativa y co-localización de las proteínas marcadas. Modalidades de imágenes de fluorescencia más sofisticados, como las imágenes de vida de fluorescencia (FLIM), imágenes por anisotropía de polarización y anisotropía de imágenes de fluorescencia resuelta en el tiempo, no son ampliamente explotados en los instrumentos comerciales de la CHA, aunque ofrecen lecturas cuantitativas de gran alcance, por ejemplo, de las interacciones proteína. Aquí presentamos un enfoque de código abierto para la implementación de Flim en un microscopio automatizado para HCA.
vida de fluorescencia proporciona una lectura espectroscópica inherentemente radiométrica que se puede utilizar para distinguir diferentes especies moleculares o para sondear el entorno molecular local de un fluoróforo y es insensible a la concentración de fluoróforo, a eficiencias de excitación / detección, y al impacto de Scatteanillo y la absorción de la muestra 2. Además, ya que las mediciones de vida de fluorescencia pueden realizarse en un solo canal espectral, que son directamente comparables entre los diferentes instrumentos y muestras sin calibración. Ellos se pueden aplicar a fluoróforos endógenos, incluyendo algunos metabolitos celulares, lípidos y componentes de la matriz extracelular, para proporcionar lecturas intrínsecas de los procesos biológicos y patologías. Por lo tanto libre de etiquetas FLIM puede asignar cambios metabólicos en las células de 3,4 y se ha aplicado para controlar la diferenciación de células madre 5,6 y el crecimiento de los andamios de colágeno 7. Recientemente hemos demostrado que FLIM HCA puede ser utilizado para ensayos libres de etiquetas automatizados del metabolismo celular utilizando autofluorescencia 8. Más comúnmente, sin embargo, las mediciones de fluorescencia vida y Flim se aplican a fluoróforos exógenos que etiquetan biomoléculas específicas, a menudo implementado utilizando colorantes que tiñen compartimentos celulares, el uso de tintes acoplado a antibodies que se dirigen a proteínas específicas en células fijadas, o el uso de fluoróforos expresadas genéticamente acoplados a proteínas específicas. vida de la fluorescencia se puede utilizar para proporcionar lecturas robustas cuantitativos de sondas fluorescentes de detección de su entorno físico o químico. Para ejemplos, colorantes han sido desplegados para detectar la fase lipídica locales de las membranas celulares 9 o la viscosidad de células 10 y biosensores basados en proteínas fluorescentes expresados genéticamente han sido desarrollados para reportar concentraciones de células moléculas de señalización, incluyendo como IP3 11, PIP2 12 y calpaína 13 o iones tales como calcio 14,15, potasio y cloruro de 16 17.
Muchos de estos biosensores utilizan Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) 18,19 para proporcionar lecturas de los cambios en la conformación biosensor. FRET entre los fluoróforos aceptores "" "donante" y se produce a través de una interacción dipolo-dipolo directa de corto alcancepara los que los fluoróforos están normalmente separados por menos de ~ 10 nm. Así, la detección de FRET indica la proximidad de proteínas apropiadamente marcados y por lo tanto proporciona un medio para leer las interacciones proteína-proteína 20, tales como la unión o la oligomerización – ya sea como puntos finales en células fijadas o eventos dinámicos en las mediciones curso temporal de la vivo Células. Al etiquetar un constructo molecular apropiado con donante y aceptor fluoróforos, también es posible leer los cambios conformacionales – o escisión – de la construcción a través del cambio en FRET y esta es la base de muchos biosensores 21. Las mediciones de la eficiencia de FRET pueden proporcionar información sobre la distancia donador-aceptor y la fracción de la población de fluoróforos donantes sometidos FRET. Por lo tanto, las técnicas de imagen basados en FRET se pueden utilizar para mapear y cuantificar las interacciones moleculares en el espacio y tiempo, por ejemplo, para dilucidar los procesos de señalización celular 22. Aparato mecánicoing tales técnicas de imagen podrían proporcionar ensayos de alto rendimiento basado en las lecturas de las vías o redes de señalización.
En HCA, la lectura de FRET más comúnmente implementado es de imagen radiométrica espectral, donde se asignan los cambios en la proporción de aceptor con la intensidad de los donantes. Si bien este enfoque se implementa fácilmente – y está disponible en muchos lectores de placas de múltiples pocillos disponibles comercialmente – mediciones FRET espectralmente resueltos cuantitativos requieren una calibración de la respuesta espectral del sistema 23. Esto incluye espectral diafonía derivada de espectral derrame y de excitación directa del aceptor, así como las características de transmisión del instrumento y la muestra (efecto de filtro interno). En principio, esto implica la medición de muestras adicionales de "control" que están etiquetados con cualquiera de los donantes de sólo o aceptor de sólo.
A partir de estas mediciones de FRET radiométricos espectrales, una FRET efectivaeficiencia (el producto de la eficiencia de FRET real y la fracción de FRETing moléculas donante / aceptor) se puede obtener junto con la proporción relativa de las moléculas de donante y aceptor 24. FRET radiométrica espectral se utiliza a menudo con biosensores FRET unimolecular, donde la estequiometría donante / receptor puede ser supone que se conocen. Para determinar las fracciones de población del donante FRETing y aceptor, por ejemplo, para obtener una curva de respuesta a la dosis, se requiere el conocimiento de la eficiencia de FRET real. Esto puede obtenerse mediante la medición de una muestra de control positivo FRET con propiedades conocidas o mediante el uso de un método diferente para medir la eficiencia de FRET, tal como photobleaching aceptor o FLIM.
El uso de lecturas de vida de la fluorescencia, FRET puede ser detectado y cuantificado por mediciones de la emisión del donante solo – la eliminación de la necesidad de calibración espectral y otras muestras de control. Por lo tanto, las lecturas Flim FRET se pueden comparar entre los instrumentosy entre diferentes muestras – permitiendo que los datos de endoscopia o tomografía de modelos de enfermedad en vivo 25 a partir de referencias contra las mediciones de ensayos basados en células. Mediante el ajuste de los perfiles de decaimiento de fluorescencia del donante a un modelo de decaimiento exponencial de múltiples apropiada correspondiente a FRETing y poblaciones de donantes no FRETing, FRET eficiencias y fracciones de población pueden, en principio, ser obtenidos directamente sin realizar más mediciones. Estas ventajas significativas, sin embargo, vienen a costa de FLIM requiere fotones más detectados por píxel de la imagen de intensidad espectralmente resuelta – típicamente cientos de fotones se requieren para lograr una precisión en la determinación del tiempo de vida de 10% en el montaje a un único modelo de decaimiento exponencial y cuando perfiles de decaimiento de la fluorescencia de ajuste a modelos complejos (Decay multiexponencial), el número de fotones detectados aumenta a miles requiere. Esto ha llevado convencionalmente para largos tiempos de adquisición (decenas a cientos de segundos por campo de view) de Flim, particularmente cuando se usa el tiempo correlacionada recuento de fotones individuales (TCSPC) implementado con la adquisición de píxeles secuencial en microscopios de barrido láser. Los intentos de aumentar la velocidad de formación de imágenes mediante el uso de altas intensidades de excitación puede conducir a photobleaching y / o fototoxicidad significativa. Junto con la falta de herramientas de instrumentación y software disponibles comercialmente apropiados, esto ha dificultado Flim de ser utilizado en el HCA para el descubrimiento de fármacos o sistemas de biología, donde cientos de miles de campos de visión son a explorar. El escaneo láser TCSPC Flim ha sido implementado en un microscopio placa de múltiples pocillos automatizado 26 para mediciones secundarias después de la identificación de los "éxitos" de la polarización de resolución temporal de imágenes anisotropía de fluorescencia en estado estacionario 27, que puede alcanzar velocidades de exposición similares a la imagen radiométrica espectral 28 con el que comparte muchas ventajas y desventajas. imágenes de fluorescencia anisotropía explota la disminuciónen la anisotropía de fluorescencia del aceptor en la presencia de FRET y también es sensible a la diafonía espectral (por ejemplo, la excitación directa del aceptor). Se requiere la calibración para tener en cuenta la polarización diafonía y no proporciona una medición directa de la eficiencia de FRET.
Para darse cuenta de las ventajas de Flim de HCA, hemos trabajado para hacer frente a los problemas de velocidad de adquisición de imágenes y un mayor acceso a la tecnología. A continuación, ofrecemos una lista completa de los componentes de software de código abierto y hardware que pueden ser utilizados para implementar el lector Flim rápido automatizado de múltiples pocillos de placa que se describe a continuación, junto con los ensayos basados en FRET-ejemplar. En nuestro enfoque 29, FLIM se realiza usando en todo el campo de la imagen de tiempo de cerrada utilizando una cerrada intensificador de imagen óptica (GOI), que se ilustra en la Figura 1 que puede proporcionar velocidades de formación de imágenes más rápidas y más baja photobleaching que un solo haz TCSPC de exploración debido a la interr pixel paraleloogation. Nuestro instrumento openFLIM-HCA puede proporcionar Flim sin supervisión, lo que requiere sólo unos pocos segundos para adquirir datos Flim detección de unos 100 fotones por píxel (en función del brillo de la muestra). Combinado con el tiempo requerido para mover la muestra desde el campo anterior de vista, para ajustar la configuración de adquisición y para mantener la muestra en el foco, esta típicamente resulta en tiempos de adquisición de placa de múltiples pocillos de ~ 10 s por campo de visión 25,28. Seccionamiento óptico se puede implementar utilizando un gran campo cuasi Nipkow ( "disco giratorio") escáner 30.
Para el análisis de los datos Flim, hemos desarrollado una herramienta de software de código abierto llamado FLIMfit 31 que es capaz de analizar rápidamente los conjuntos de datos de múltiples pocillos placa de Flim en estaciones de trabajo de PC convencionales y es un plug-in para 32 de OMERO. FLIMfit proporciona capacidades de análisis globales (que se examinan en la sección 1.2) que permiten Flim datos a ser instalados en los modelos complejos con Oólo unos 100 fotones por píxel bajo el supuesto de que los componentes de vida de fluorescencia son invariantes a través de una imagen o región de interés (ROI), por lo tanto reducir el número de fotones detectados se requiere, la exposición a la luz al tiempo de la muestra y la adquisición de imágenes. Correr FLIMfit en un PC de escritorio estándar, requiere sólo 10 segundos de segundos de tiempo de cálculo para analizar conjuntos de datos que comprenden cientos de FOV. Así, tanto la adquisición de datos y análisis Flim pueden llevarse a cabo en escalas de tiempo que sean prácticos para HCA.
hardware openFLIM-HCA
Nuestra aplicación de HCA Flim comprende seis componentes principales: (i) un marco microscopio de fluorescencia con autofocus óptica; (Ii) un (xyz) platina del microscopio motorizado; (Iii) una fuente de láser de excitación; (Iv) un sistema de Flim tiempo-dependientes de campo amplio con intensificador cerrada óptica (GOI), generador de retardo y la cámara; (V) un ordenador para la adquisición de datos y análisis, y (vi) un escáner de disco Nipkowunidad para la formación de imágenes ópticamente seccionada para suprimir de enfocar la luz. Esto puede ser importante cuando se generan imágenes señales débiles, por ejemplo, a partir de biosensores FRET en la membrana plasmática de la célula, que podrían ser inundados por las contribuciones de la fluorescencia citoplasmática o el fondo del cubreobjetos o medio de cultivo. datos FLIM Time-cerrada se adquiere mediante la iluminación de la muestra con el ultracorto pulsado radiación de excitación, imágenes de la emisión de fluorescencia para el fotocátodo del GOI y la adquisición de una serie de imágenes CCD de la de fósforo del GOI de una gama de ajustes de retardo de tiempo de intensificador de la puerta óptica después de la llegada de los pulsos de excitación. A medida que aumenta el retardo de puerta tiempo después de la excitación, la señal de fluorescencia se ve a disminuir y la serie de imágenes de intensidad de fluorescencia tiempo-gated adquiridos en el CCD formar el conjunto de datos necesarios para analizar los perfiles de desintegración de todos los fluoróforos en el campo de visión . El gating del GOI está sincronizado con los impulsos de excitacióny, para la serie de adquisiciones CCD, el retardo de la puerta del tiempo con respecto a los pulsos de excitación se establece en una serie de valores crecientes en el rango deseado. Esta sincronización se logra mediante el generador de retardo que comprende una "caja rápida demora" (que proporciona retrasos de hasta 20 ns en pasos de 1 ps) y una "caja de retardo basto" que proporciona retrasos con un paso mínimo de 25 ps.
Para FLIM, la excitación puede ser proporcionado por cualquier láser ultrarrápido. Por conveniencia, se emplean típicamente una fuente supercontinuo fibra láser bombeado que proporciona impulsos de picosegundos sintonizable en todo el espectro visible de la que la radiación de excitación apropiada puede seleccionarse para cualquier fluoróforo con una rueda de filtros motorizada con diferentes filtros de paso de banda. Típicamente, se utiliza una potencia media de ~ 100-200 mW en la muestra con pulsos a una velocidad de repetición 40 o 60 MHz. Tales poderes de excitación también podrían ser proporcionadas por fuentes de láser ultrarrápidos en base a la frecuencia de duplicaciónde modo bloqueado de titanio dopado con láseres de zafiro. Tenga en cuenta que una duración de pulso de excitación por debajo de ~ 100 ps es suficiente para la mayoría de los experimentos. Una segunda rueda de filtros motorizado equipado con filtros de densidad neutra se utiliza para regular la intensidad de excitación. Para la seguridad y la comodidad, la radiación de excitación puede ser entregado a través de una fibra óptica de modo único. Las configuraciones para FLIM de campo amplio y FLIM ópticamente seccionada se presentan en las Figuras 2 y 3 respectivamente. Para más detalles de los componentes precisos utilizados, por favor visite el openFLIM-HCA wiki de 33. Una copia de la lista de piezas actual se da en el material complementario.
Para Flim de gran campo, se requiere que la radiación de excitación para iluminar todo el campo de visión lo más uniformemente posible. Para ello dirigir el haz de láser de excitación a un difusor holográfico "top-hat" que se hace girar a 10 a 50 Hz en cuando a la media del moteado de láser, con el plano de la difusor está formando la imagen hasta el plano focal posterior de la lente objetivo del microscopio. La imagen de fluorescencia del puerto de salida del microscopio se retransmite en el fotocátodo del GOI y el fósforo del GOI (área activa diagonal 18 mm) se forma la imagen sobre el sensor de un CCD científica enfriada (tamaño de la viruta 10,2 mm x 8,3 mm) cámara usando un par de lentes de la cámara que proporcionan un aumento de 0,7. El sistema está controlado por un PC estándar que se interconecta a la instrumentación utilizando protocolos RS232. Además, un microprocesador Arduino se utiliza para controlar un obturador en la trayectoria de luz de excitación que está cerrada excepto cuando la cámara CCD está adquiriendo datos Flim y para grabar la señal de un fotodiodo que se utiliza para medir la potencia media de la supercontinuo espectralmente filtrada fuente de excitación. Para FLIM ópticamente seccionada, la radiación láser de excitación se acopla en una fibra óptica monomodo mantenedora de polarización que se conecta directamente a la unidad de escáner de discos Nipkow, como shown en la Figura 3. La imagen de fluorescencia de salida de la unidad de escáner Nipkow se retransmite en el fotocátodo del GOI y el resto del sistema es el mismo que para FLIM de campo amplio.
software openFLIM-HCA
El software de adquisición de datos se escriben en μManager 34. Proporciona la funcionalidad de adquisición de datos completa HCA incluyendo opciones para cambiar la secuencia en la que se crean imágenes de los pocillos de la placa, para adquirir los cursos de tiempo para cualquier campo de visión, para mantener automáticamente el enfoque durante las mediciones y para controlar las ruedas de excitación y filtros de emisión y el cambiador dicroico para formación de imágenes multicolor automatizado. También es posible ejecutar una adquisición "pre-escaneado" de la intensidad de fluorescencia con el fin de identificar automáticamente y registrar las posiciones de FOV adecuados para una adquisición FLIM posterior de acuerdo con los criterios, por ejemplo, en base a la intensidad. HCA datos Flim se pueden guardar como una seriede archivos TIFF, como una serie de archivos de OME-TIFF (es decir, uno por FOV) o como un solo archivo TIFF-OME incorporando todos los datos de una placa de múltiples pocillos. Más información y una descripción detallada del software μManager se pueden encontrar en la openFLIM-HCA wiki de 33.
El software de análisis de datos, FLIMfit 31, un cliente de código abierto basado en MATLAB para la imagen de OMERO plataforma de gestión de datos de 32, es capaz de leer los datos desde un servidor de Flim de OMERO o desde el disco del ordenador, como se indica en la Figura 4. Ha sido diseñado para analizar los datos de TCSPC o instrumentos Flim tiempo-dependientes de campo amplio y ofrece muchas posibilidades para ajustar los datos de openFLIM-HCA incluida la instalación de monoexponencial perfiles de decaimiento, y duplicar perfiles exponenciales y superior de desintegración complejidad, incluyendo modelos como perfiles de decaimiento de fluorescencia de resolución temporal de polarización. También se puede tener en cuenta las señales de fondo fijas y variables en el tiempo y puede utilize una función medido espacio-temporal respuesta del instrumento (IRF) o puede caber usando un IRF idealizada que puede ser desplazado en el tiempo sobre una base de pixel-sabia por una cantidad determinada a partir de la medición experimental completo IRF. Una diferencia de tiempo global (t 0) entre el IRF y una muestra fluorescente puede determinarse a partir de una medición de un nivel de fluorescencia. Las variaciones espaciales en las señales de fondo y IRF también se pueden tener en cuenta. FLIMfit es capaz de encajar Flim datos en una base de pixel-sabia o el uso de "binning global" o "ajuste global" para facilitar el ajuste de los datos Flim con modestos (cientos) de fotones números de modelos de desintegración complejas.
Binning Global implica la agregación de todos los fotones detectados de los píxeles dentro de una ROI definida por el usuario en cada punto de tiempo para proporcionar los números de fotones suficientes para que ajuste a modelos de desintegración complejos. El retorno de la inversión puede ser todo el campo de visión (FOV), puede ser manualmente defined por el usuario, o se puede determinar utilizando herramientas de segmentación de imágenes. El retorno de la inversión también se puede definir usando máscaras importados en FLIMfit de otro software de segmentación de imágenes. Para las aplicaciones de FRET, es común el uso de binning mundial para adaptarse a un modelo de doble decaimiento exponencial para determinar los componentes de vida de fluorescencia correspondientes a FRETing y fluoróforos donante no FRETing que se supone que son espacialmente invariantes a través de la ROI y luego volver a colocar en una base pixel a gota con estos valles de componentes fijos de por vida con el fin de obtener la fracción de la población de donantes FRETing en cada píxel.
Ajuste global implica simultáneamente el montaje de los componentes de toda la vida y las fracciones de población de donantes FRETing pixel-sabia en toda una FOV- oa través de un conjunto de datos Flim que podría comprender múltiples FOV, por ejemplo, a partir de un experimento de placa de múltiples pocillos o una serie temporal de imágenes de fluorescencia vida. ajuste global es capaz de explotar el VARIATI espacialen las fracciones de la población a través de la imagen que se perdieron en el enfoque binning global para proporcionar restricciones más fuertes sobre la estimación de vida componente – y los resultados por lo tanto más fiables – aunque a costa de computación significativamente más 35. FLIMfit puede analizar rápidamente pocillos múltiples conjuntos de datos de la placa de Flim con ajuste global sobre las estaciones de trabajo de PC convencionales con, por ejemplo, un conjunto de múltiples pocillos tiempo cerrada datos Flim, adquirida con cinco portales de tiempo para cada uno de 394 FOV que comprenden cada una 672 x 512 píxeles, que requiere sólo 32 segundos y 2 GB de memoria para adaptarse a un modelo de decaimiento exponencial doble 31. Esto se ha logrado mediante la utilización de un no lineal separable menos algoritmo de ajuste cuadrado implementado usando algoritmos paralelos multiproceso para permitir una ampliación efectiva en procesadores multi-núcleo y el código FLIMfit ha sido optimizado para minimizar el uso de memoria. La figura 5 muestra una instantánea de la interfaz gráfica de usuario de FLIMfity más detalles se pueden encontrar en la página web determinada en referencia 36. Para más información sobre el ajuste global y hurgar en la basura mundial se puede encontrar en la referencia 31.
El siguiente protocolo para HCA Flim usando nuestra instrumentación openFLIM-HCA y el software se puede adaptar para una amplia gama de experimentos de imagen celular con lecturas Flim. En general, placa de múltiples pocillos FRET experimentos deben ser diseñados para incluir pocillos duplicados de los controles biológicos positivos y negativos, además de las condiciones que se está estudiando. A continuación, describimos la aplicación específica a realizar FLIM ópticamente en sección (véase la Figura 3) de las células COS que expresan construcciones de FRET consiste en la proteína fluorescente mTurquoise y proteína fluorescente Venus unidos por un engarce corto péptido. Aquí el mTq32V, mTq17V y mTq5V FRET construcciones (que se examinan en la sección de resultados representativos) proporcionan altas eficiencias de FRET baja, media y junto con la no FRETing mTq5A construir.Estas construcciones y los demás materiales necesarios para seguir este protocolo se enumeran en la Lista de materiales.
Hemos descrito un microscopio placa de múltiples pocillos automatizado diseñado para el uso de HCA Flim-tiempo cerrada. Este instrumento se controla mediante el software de código abierto escrito en μManager con la opción de guardar los datos en un servidor de OMERO y el análisis de datos Flim está llevando a cabo utilizando FLIMfit 36, un programa de código abierto escrito en MATLAB y disponible como un cliente de OMERO 32 El instrumento μManager software de control, openFLIM-HCA, está disponible en línea 33 con una lista de los componentes del sistema 48 para permitir a los investigadores académicos para construir sus propios instrumentos Flim HCA.
Con el fin de adquirir los datos Flim robustas, es necesario optimizar la configuración de adquisición GOI y CCD y para tener en cuenta cualquier variación en t = 0. Como se describe en 3.8.2, el ajuste de ganancia y la cámara CCD tiempo de integración GOI debe establecerse para alcanzar ~ 75% de la gama dinámica CCD. Tcantar más altos voltajes GOI y múltiples acumulaciones marco del CCD en cada retardo puerta del tiempo aumenta la relación señal-ruido de 49, pero esto aumenta el tiempo total de adquisición Flim (ya que un menor número de fotones de fluorescencia se adquieren por trama antes de que los ácidos grasos saturados de cámaras CCD y por lo que el número de acumulaciones de trama debe aumentarse) y por lo que este equilibrio debe decidirse para cada experimento. La calibración del generador de retardo depende de la tasa de repetición del láser y por lo tanto es necesario asegurarse de que el archivo de calibración correcta para la tasa de repetición utilizado se carga en el software de adquisición. El procedimiento para calibrar el cuadro de retardo se puede encontrar en la openFLIM-HCA wiki de 33.
Si la autofluorescencia celular es baja en comparación con la señal de fluorescencia, se utiliza la señal procedente de un medio de cultura de la equidad también contiene proporcionar los antecedentes variable en el tiempo (TVB). Para minimizar la fluorescencia de fondo del medio de cultivo celular, evitamosmedios que contienen fenol rojo. Si la autofluorescencia celular es significativa, entonces el TVB se puede derivar de las mediciones de las células no marcadas. Sin embargo, en este caso se debe tener cuidado, ya que esto supone que el fondo de autofluorescencia es el mismo para cada píxel de la imagen. Este supuesto no será válido si la autofluorescencia varía significativamente a través de una celda o si el haz de excitación o la sensibilidad de detección no es uniforme en todo el campo de visión.
La adquisición de una imagen IRF usando dispersos pulsos de luz de excitación proporciona el perfil IRF temporal que se convoluciona con el modelo de datos en el proceso de ajuste y también proporciona un mapa de la variación espacial de la IRF a través del campo de visión. El IRF se puede medir por la formación de imágenes de una muestra de dispersión tal como una suspensión coloidal aunque, en nuestro instrumento, usando luz de excitación dispersada desde el disco Nipkow proporciona una medición más limpio de la IRF. La determinación precisa del tiempo of el IRF es importante porque los errores en el retardo de tiempo entre la excitación y el tiempo-gating pueden afectar significativamente el proceso de adaptación, en particular en el montaje de los modelos de decaimiento exponencial compleja. La IRF adquirió usando luz de excitación dispersa no es exactamente lo que se necesita para el proceso de adaptación, ya que se registra en la longitud de onda de excitación en lugar de a la longitud de onda de emisión de fluorescencia, lo que puede afectar a su tiempo, a pesar de la variación espacial de la IRF debe ser el mismo en ambas longitudes de onda. Además, el IRF dispersa puede ser desplazada a nivel mundial en el tiempo en relación con la verdadera IRF debido a una longitud de trayectoria óptica diferente de la dispersión de objeto, como es el caso de un IRF adquirido desde el disco Nipkow en FLIM ópticamente seccionada. Esta corrección, t 0, que es el cambio temporal global necesaria que se debe aplicar a la IRF luz de excitación dispersa adquirida, se calcula a partir de los datos de colorante de referencia monoexponenciales como se indica en Protocol paso 4.4. Los siguientes colorantes se pueden utilizar para diferentes longitudes de onda de excitación: una cumarina 153 solución 75 M en metanol (τ ~ 4,3 ns 50) puede ser utilizado para la excitación en el intervalo de 295-442 nm; un 6 solución 75 M de cumarina en etanol (t ~ 2,43 ns 37) se pueden utilizar para la excitación en el intervalo de 430-500 nm; y un 75 mM solución de rodamina B en agua (τ ~ 1,7 ns 37) puede ser utilizado para la excitación en el intervalo de 488-575 nm. Observamos que, aunque es posible en FLIMfit utilizar un IRF diferente para cada pixel del sistema, por lo general es razonable hacer la hipótesis de que el IRF espacialmente variable tiene el mismo perfil temporal para cada pixel en la imagen, pero presenta una gama de espacialmente variable desplazamientos temporales relativos a la T Global 0. Se describe esto como el mapa de cambio de la FIC, que se determina a partir de la IRF luz dispersada. En conjunto, el perfil de la FIC, t 0 y el mapa de cambio de IRF se utilizan para bañoasegurarse de que cada píxel en el campo de visión está equipado con un IRF apropiado. Es importante destacar que, t 0 puede variar lentamente con el tiempo por lo que se debe medir antes de cualquier adquisición de datos Flim.
El usuario debe decidir cómo muestrear los perfiles de decaimiento de fluorescencia y se requiere para establecer el ancho de las puertas de tiempo y sus retardos relativos después de la excitación. En general, es deseable utilizar anchos de puerta amplios para maximizar la señal detectada y por lo general nos utilizar anchos de puerta establecidas a 4 ns para Flim de células marcadas con proteínas fluorescentes. El número de retrasos puerta del tiempo debe ser suficiente para probar el perfil de desintegración fluorescente (incluyendo una puerta configurar para medir la señal justo antes del pulso de excitación) dada la complejidad del modelo de ajuste que será utilizado en el análisis. El valor óptimo puede depender de los tiempos de vida y las amplitudes relativas de los componentes de desintegración. En general, las 4 puertas son suficientes para monoexponencial apropiado decae mientras que 7 o más puertas puedenser utilizado para los modelos de desintegración más complejas.
Observamos que Flim se puede implementar utilizando una serie de técnicas de dominio de tiempo o dominio de la frecuencia y automatizado HCA Flim de matrices placa de múltiples pocillos se implementó por primera vez en una lista (no seccionamiento) microscopio de campo amplio uso de las lecturas de toda la vida dominio de la frecuencia de FRET 51. Se informó entonces el primer lector de placas de múltiples pocillos óptica seccionamiento Flim automatizado para la utilización de HCA en todo el campo de la imagen-tiempo cerrada 28. Posteriormente, se aplicó en todo el campo (no seccionamiento) dominio de la frecuencia Flim HCA para detectar translacional modificaciones de correos (de fosforilación de la tirosina) a través de una biblioteca de genes utilizando FRET 52 y HCA Flim tiempo-dependientes se ha aplicado a los ensayos de FRET de VIH-1 Gag oligomerización 53 y de Sumoylation de FOXM1 54 y de Raichu RhoA y Rac1 biosensores 33. También es posible utilizar TCSPC para múltiples pocillos FLIM placa 26 pero hasta la fecha ha resultado difícil para que coincida con tque el rendimiento de las técnicas que explotan la detección de campo amplio. Un enfoque emergente que podría abordar este problema es el uso de conjuntos de detectores recuento de fotones individuales, tales como matrices SPAD 55.
Observamos que las lecturas de FRET utilizando proteínas fluorescentes deben ser tratados con precaución y que los valores absolutos de los parámetros obtenidos a partir de FLIMfit o cualquier otro software de análisis Flim dependerá de los supuestos asociados con el modelo apropiado. Por ejemplo, cuando el donante de FRET tiene una segunda componente significativo decaimiento, el uso de un modelo biexponencial para ajustar los datos de FRET Flim puede resultar en la contribución de la componente de decaimiento rápido, típicamente asociado con la población FRETing que aparece más alto de lo que debería. Por tanto, es deseable utilizar los donantes con una vida útil mono-exponencial como mTq2FP. Incluso entonces, los estudios recientes han demostrado que el análisis FRET todavía puede verse afectada por estados oscuros de proteínas de fluorescencia aceptor o porheterogeneidad del factor de orientación κ 2 debido a una distribución de conformaciones fluoróforo con una variedad de ángulos y distancias cromóforos 56. Sin embargo, nosotros y otros han demostrado que las lecturas de vida de la fluorescencia de FRET sí producen resultados útiles que se correlacionan con las mediciones bioquímicas y pueden ser utilizados para la detección de interacciones de proteínas o para seguir la dinámica de biosensores. Por lo tanto esta plataforma HCA openFLIM se puede aplicar a una amplia gama de ensayos basados en vida de fluorescencia utilizando FRET o autofluorescencia celular 8, así como que proporcionan lecturas cuantitativas de sondas basadas en colorantes 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |