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Biochemistry

विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए

Published: March 05, 2017
doi:
10.3791/55148
, , ,
1Department of Biosciences and Nutrition,Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health,KTH Royal Institute of Technology

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

चिकित्सा अनुसंधान में, ज्यादा ध्यान झिल्ली प्रोटीन, या तो आंतरिक या बाह्य, लिपिड बातचीत की एक किस्म में शामिल करने पर केंद्रित है। लिपिड बातचीत प्रोटीन के साथ कार्य करना या तो, इस तरह के डिटर्जेंट के रूप में लिपिड, करने के लिए एक विकल्प का चयन 1 amphipols, या छोटे प्रोटीन 2, या एक झिल्ली विकल्प है कि प्रोटीन घुलनशील और सक्रिय रहता है खोजने भी शामिल है। Lipoic झिल्ली के विकल्प liposomes और nanodiscs (एनडी) 3, 4 शामिल हैं।

Nanodiscs के पास देशी झिल्ली प्लेटफार्मों, प्रोटीन हिस्सा है, ApoA -1 इंजीनियरिंग उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) स्वाभाविक रूप से रक्त में होने वाली द्वारा विकसित कर रहे हैं। ApoA-1 कम amphipathic α-सर्पिलों की एक 243 अवशेषों से लंबी श्रृंखला है और एक लिपिड मुक्त घुलनशील रचना है। इन विट्रो में लिपिड की उपस्थिति में, प्रोटीन ApoA -1 की दो प्रतियां अनायास hydr घेरना पुनर्व्यवस्थित जबएक लिपिड bilayer पैच 5 ophobic एसाइल श्रृंखला भाग। ApoA -1 के इंजीनियर संस्करण आम तौर पर झिल्ली मचान प्रोटीन (एमएसपी) कहा जाता है, और एक बढ़ती हुई संख्या plasmids के रूप में या शुद्ध प्रोटीन के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। अब 6 या 7 छोटे झिल्ली मचान प्रोटीन में repetitions या α-सर्पिलों का विलोपन ApoA-1 परिणाम में। बदले में यह संभव 7 एनएम के लिए 17 8 व्यास में 6 एनएम के आसपास डिस्क फार्म के लिए बनाता है। वहाँ nanodiscs 3, 9 के लिए आवेदनों की विभिन्न प्रकार हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किया आवेदन एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन 8 के स्थिरीकरण के लिए एक के पास देशी झिल्ली पर्यावरण, पहले 3, 9 की समीक्षा प्रदान करना है। एक कम-पता लगाया उपयोग के अध्ययन के लिए एक nanoscale झिल्ली सतह प्रदान करने के लिए हैपरिधीय झिल्ली प्रोटीन 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17। प्रोटोकॉल की धारा 1 नीचे फॉस्फोलिपिड और झिल्ली मचान प्रोटीन से बना nanodiscs बनाने के लिए प्रक्रिया visualizes।

नमूना तैयार सबसे तरीकों में एक अड़चन है। विधि-विशेष के नमूने विशेष जानकारी जोड़ सकते हैं, लेकिन वे भी परिणाम की तुलना कठिन बनाते हैं। इसलिए, यह आसान है जब नमूने बहुविध कर रहे हैं और कई अलग अलग तरीकों में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। Nanodiscs के उपयोग के साथ एक लाभ यह liposomes (जैसे, नमूने सीधे, दोनों मंदिर और गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में) की तुलना में nanodisc के छोटे आकार के है।

<p clasएस = "jove_content"> vesicles और liposomes लंबे झिल्ली बातचीत प्रोटीन के समारोह को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है। संरचनात्मक अध्ययन और दृश्य के लिए, liposomes में एक transmembrane प्रोटीन के संरचनात्मक दृढ़ संकल्प का एक उदाहरण उपलब्ध 18 है। हालांकि, एक monotopic झिल्ली प्रोटीन का कोई उच्च संकल्प 3 डी संरचना एक liposome झिल्ली पर एम्बेडेड अभी तक प्रकाशित किया गया है, हम जानते हैं के रूप में दूर के रूप में। सोना नैनोकणों या एंटीबॉडी liposomes या पुटिकाओं मंदिर 19 उपयोग करने के लिए बंधनकारी प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि इन जांच बहुत विशिष्ट होते हैं, वे झिल्ली बाध्यकारी साइट परदा द्वारा या लचीला भागों के साथ हित के क्षेत्रों मास्किंग द्वारा झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। गोल्ड लेबल या एंटीबॉडी complexed प्रोटीन शायद एक जेल पर विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन इस प्रयोग की लागत बढ़ जाएगी।

हालांकि liposomes एक उत्कृष्ट मंच हैं, एक है कि पॉप कुछ नहीं हो सकताआबादी liposome प्रति प्रोटीन की एक विशेष अनुपात, एक विशेषता यह है कि nanodiscs 20 के प्रयोग से पता लगाया जा सकता है। एक liposome में, सहकारकों और substrates घुलनशील इंटीरियर में फंस जा सकता है। पदार्थ है कि झिल्ली में घुलनशील हैं झिल्ली mimetics के दोनों प्रकार के लिए एक ही किस्मत का हिस्सा होगा। फिर भी, के रूप में bilayer क्षेत्र nanodiscs में छोटा होता है, पदार्थ की एक छोटी राशि nanodisc झिल्ली तर करने के लिए आवश्यक है।

परमाणु संरचना के निर्धारण के माध्यम से समझ प्रोटीन समारोह अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए आवश्यक हो गया है। प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए तरीके एक्स-रे 21 शामिल हैं; परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), 22, 23; और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) क्रायोजेनिक तापमान पर 24, cryoEM। cryoEM द्वारा संकल्प हाल ही में काफी सुधार किया गया है, मुख्य रूप से प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डी के उपयोग के कारण25 tectors, 26। बड़े अणुओं एक के पास देशी राज्य में पतली, कांच का बर्फ 27 में imaged हैं। 200 केडीए – हालांकि, जैविक अणुओं के विपरीत कम होने की वजह से वे 100 के आकार की सीमा में पता लगाने के लिए मुश्किल हो गया है। उपयुक्त आकार के नमूने लिए, डेटा संग्रह किया जा सकता है और एक कण पुनर्निर्माण की विधि एक संरचना 28 प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है।

हालांकि, मंदिर से प्रोटीन संरचना के निर्धारण के लिए एक multistep प्रक्रिया है। यह आमतौर पर नकारात्मक दाग मंदिर 29 phosphotungsten (पीटी) 30 या 31 यूरेनियम जैसे भारी धातुओं के लवण का उपयोग करके नमूना monodispersity के मूल्यांकन के साथ शुरू होता है। नकारात्मक दाग macromolecule के एक कम संकल्प मॉडल के पुनर्निर्माण आमतौर पर किया जाता है और आणविक संरचना 29 पर महत्वपूर्ण जानकारी उपज हो सकती है। समान्तर में,डेटा संग्रह का उपयोग कर cryoEM शुरू कर सकते हैं। केयर जब नकारात्मक दाग मंदिर डेटा का मूल्यांकन मूर्ति गठन की गलत व्याख्या से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। एक विशेष रूप से मूर्ति फॉस्फोलिपिड पर पीटी दाग का प्रभाव है और 32 liposomes, लंबे पक्ष 33 से देखी सिक्के के ढेर जैसी छड़ के गठन में जिसके परिणामस्वरूप। इस तरह के "Rouleau" या "ढेर" (इसके बाद "ढेर" के रूप में चिह्नित) nanodiscs 35 के लिए एचडीएल 34 के लिए जल्दी पर मनाया गया, और बाद में भी।

स्टैकिंग और झिल्ली के reshaping कई कारणों से हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह तांबे की तरह सह कारकों, एक अमोनियम molybdate दाग 36 में मंदिर इमेजिंग द्वारा दिखाए गए द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। liposomes में झिल्ली लिपिड का एक अंश EDTA द्वारा धातु complexation नकल उतार एक iminodiacetic एसिड सिर समूह निहित है, इस प्रकार तांबा आयनों के अलावा के बाद liposomes स्टैकिंग <sअप वर्ग = "xref"> 36। Stacking भी या लिपिड bilayers पर एक प्रोटीन द्वारा एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की वजह से हो सकता है (इस्तेमाल किया दाग उल्लेख नहीं है) 37। पीटी द्वारा फॉस्फोलिपिड के ढेर गठन जल्दी पर मनाया गया; हालांकि, बाद में काम को हटाने या इस विरूपण साक्ष्य गठन 38 को खत्म करने पर ध्यान केंद्रित किया है।

यहाँ, हम NAPT प्रेरित nanodisc मंदिर से झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन के अध्ययन के लिए स्टैकिंग का लाभ लेने के लिए एक विधि का प्रस्ताव। संक्षेप में, प्रोटीन nanodiscs पर बाध्यकारी स्टैकिंग से nanodiscs को रोका जा सके। हालांकि स्टैकिंग के लिए कारण स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, यह 39 प्रस्तावित किया गया था फॉस्फोलिपिड और पीटी का phosphoryl समूह के बीच एक electrostatic बातचीत है कि, एक दूसरे को (चित्रा 1 ए) के लिए छड़ी करने के लिए डिस्क के कारण। हमारे प्रोटोकॉल के पीछे परिकल्पना है कि जब एक प्रोटीन एक nanodisc को बांधता है, फॉस्फोलिपिड सतह के सबसे availa नहीं है प्रोटीन से steric बाधा के कारण पीटी के साथ बातचीत के लिए ble। यह स्टैक गठन (चित्रा 1 बी) को रोका जा सके। दो निष्कर्ष निकाला जा सकता है। सबसे पहले, स्टैकिंग की रोकथाम मतलब यह है कि ब्याज की प्रोटीन झिल्ली के लिए बाध्य किया है। दूसरे, प्रोटीन-एनडी जटिल से जटिल के किसी न किसी आकृति विज्ञान पाने के लिए मानक एकल कण प्रसंस्करण विधियों 24, 40 के साथ इलाज किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर अप्राकृतिकरण जेल वैद्युतकणसंचलन या गतिशील प्रकाश बिखरने जैसे तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है।

इस परिकल्पना को प्रदर्शित करने के लिए, हम झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन 5-lipoxygenase (5LO) है, जो कई भड़काऊ रोगों 41, 42 में शामिल है इस्तेमाल किया। यह 78 केडीए प्रोटीन अपनी झिल्ली 43 करने के लिए बाध्य करने के लिए कैल्शियम आयनों की आवश्यकता है। हालांकि इस झिल्ली एसोसिएशन अध्ययन किया गया है बड़े पैमाने पर liposomes का उपयोग करएस = "xref"> 44, 45, 46 और झिल्ली अंशों 47, ये मंदिर विश्लेषण और संरचना निर्धारण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

nanodiscs की तैयारी डिटर्जेंट सोडियम cholate में resuspended लिपिड के साथ न्यूनतम समर्थन मूल्य के मिश्रण से शुरू होता है। 1 घंटे के लिए बर्फ पर ऊष्मायन के बाद, डिटर्जेंट धीरे-धीरे एक पी लेनेवाला राल का उपयोग पुनर्गठन मिश्रण से निकाल दिया जाता है। सामग्री के इस प्रकार अक्सर छोटे मोती में आकार polystyrene से बना है। वे अपेक्षाकृत हाइड्रोफोबिक हैं और लिपिड 48 की तुलना में डिटर्जेंट बाध्य करने के लिए एक मजबूत पसंद है। हाइड्रोफोबिक मोतियों को दूर करने और centrifugation का उपयोग स्पष्टीकरण प्रदर्शन के बाद, nanodiscs आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं। शुद्ध nanodiscs एक equimolar अनुपात (या एक अनुमापन के लिए कई अनुपात) में एक monotopic झिल्ली प्रोटीन (और संभव सहकारकों) के साथ मिश्रित कर रहे हैं और अनुसंधान करने के लिए छोड़ दिया जाता हैeact (15 मिनट)। मंदिर से विश्लेषण चमक छुट्टी दे दी, कार्बन-लेपित ग्रिड पर नमूना की μL-मात्रा में लगाने से और फिर NAPT साथ नकारात्मक धुंधला प्रदर्शन से बाहर किया जाता है। जब aliquots मंदिर ग्रिड के लिए लागू किया गया था से एक ही नमूना गैर अप्राकृतिकरण या एसडीएस पृष्ठ जेल-वैद्युतकणसंचलन, साथ ही द्वारा गतिविधि माप के विभिन्न प्रकार के द्वारा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कोई बड़े बदलाव के साथ।

Protocol

1. Nanodiscs की तैयारी अभिव्यक्ति और झिल्ली मचान 8 प्रोटीन की शुद्धि, 35 एक्सप्रेस ई कोलाई BL21 में उनकी टैग MSP1E3D1 (DE3) बोतल में T1R pRARE2 तनाव। लेग माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 माइक्रोग्र…

Representative Results

विधि हम प्रस्ताव nanodiscs की तैयारी monotopic झिल्ली प्रोटीन बाध्यकारी के लिए झिल्ली सतह प्रदान करने पर निर्भर करता है। कोई transmembrane प्रोटीन nanodisc लिपिड bilayer में एम्बेडेड है के रूप में, nanodiscs यहाँ "खाली nanodiscs&quot…

Discussion

खाली nanodiscs के पुनर्गठन, प्रोटीन-nanodisc परिसरों की तैयारी है, और इन परिसरों के मंदिर के लिए नकारात्मक धुंधला: विधि को तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है। प्रत्येक भाग तकनीक, महत्वपूर्ण कदम है, और उपयोगी संश?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों उनके समर्थन के लिए स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्टॉकहोम काउंटी परिषद, और की निधियों धन्यवाद। अभिव्यक्ति और न्यूनतम समर्थन मूल्य की शुद्धि के कारोलिंस्का Institutet / SciLifeLab प्रोटीन विज्ञान कोर सुविधा पर प्रदर्शन किया गया था (http://PSF.ki.se)। लेखकों को भी अपनी तकनीकी विशेषज्ञता को साझा करने के लिए और उनके समय पर सहायता के लिए डॉ पासी Purhonen और डॉ Mathilda Sjöberg का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL		 Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium
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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).
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