Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

Nella ricerca medica, molta attenzione è focalizzata sulle proteine ​​di membrana, sia intrinseci o estrinseci, coinvolti in una varietà di interazioni lipidi. Utilizzo di proteine lipidi interagenti comprende sia selezionando un sostituto dei lipidi, quali detergenti, amphipols ¹ o piccole proteine ^2, o trovare un sostituto membrana che mantiene la proteina solubile ed attiva. Sostituti membrana lipoico includono liposomi e nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs sono piattaforme membrana vicino native sviluppate progettando la parte proteica, ApoA-1, della lipoproteina ad alta densità (HDL) naturalmente nel sangue. ApoA-1 è un residuo di 243-lunga catena di brevi anfipatiche alfa-eliche e presenta una conformazione solubile privo di lipidi. In vitro quando in presenza di lipidi, due copie della proteina ApoA-1 spontaneamente riorganizzano per circondare il hydrophobic porzione catena acilica di un doppio strato lipidico cerotto ^5. versioni Engineered di ApoA-1 sono generalmente chiamati ponteggi proteine ​​di membrana (MSP), e un numero crescente sono disponibili in commercio come plasmidi o proteine ​​purificate. Ripetizioni o cancellazioni delle alfa-eliche in ApoA-1 risultato in più ⁶ o più brevi ponteggi proteine di membrana ^7. Questo a sua volta rende possibile l'ottenimento di dischi circa 6 nm ⁷ a 17 nm ⁸ di diametro. Ci sono diversi tipi di applicazioni per il nanodiscs ^{3, 9.} L'applicazione più comunemente usato è quello di fornire un ambiente membrana quasi nativa per la stabilizzazione di una proteina integrale di membrana ^8, recensito in precedenza ^{3, 9.} Un uso meno esplorato è quello di realizzare una superficie di membrana nanoscala per lo studioperiferica di membrana proteine ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Sezione 1 del protocollo di sotto visualizza la procedura relativa alle nanodiscs composte da fosfolipidi e proteine ​​di membrana impalcature.

La preparazione del campione è un collo di bottiglia nella maggior parte dei metodi. campioni specifici del metodo può aggiungere informazioni particolari, ma anche fare i confronti dei risultati difficili. Pertanto, è più semplice quando i campioni sono multimodale e possono essere utilizzati direttamente in diversi metodi. Un vantaggio con l'uso di nanodiscs è la piccola dimensione del nanodisc rispetto ai liposomi (ad esempio, i campioni possono essere utilizzati direttamente per entrambi TEM e non denaturante gel elettroforesi, come nel presente protocollo).

<p class = "jove_content"> vescicole e liposomi sono da tempo utilizzati per comprendere la funzione delle proteine ​​di membrana interagenti. Per gli studi strutturali e visualizzazione, un esempio della determinazione strutturale di una proteina transmembrana in liposomi è disponibile ^18. Tuttavia, nessuna struttura 3D ad alta risoluzione di una proteina di membrana monotopic incorporato in una membrana liposomiale è stato ancora pubblicata, per quanto ne sappiamo. Nanoparticelle d'oro o anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare proteine leganti di liposomi o vescicole usando TEM ^19. Anche se queste sonde sono molto specifici, potrebbero interferire con proteine ​​di membrana vincolante velando il sito di legame della membrana o mascherando le aree di interesse con le parti flessibili. Gold-etichettato o proteine ​​anticorpi complessato potrebbe probabilmente essere analizzati su un gel, ma ciò aumenterebbe il costo dell'esperimento.

Anche se liposomi sono un'eccellente piattaforma, non si può essere certi che il poplamento ha un rapporto particolare di proteine per liposoma, una caratteristica che può essere esplorato con l'uso di nanodiscs ^20. In un liposoma, cofattori e substrati possono essere intrappolati all'interno solubile. Le sostanze che sono membrana-solubili condivideranno lo stesso destino per entrambi i tipi di mimetici di membrana. Tuttavia, come la zona doppio strato è più piccola in nanodiscs, una minore quantità di sostanza è necessaria per saturare le membrane nanodisc.

proteina funzione intesa attraverso la determinazione della struttura atomica è essenziale per molti campi di ricerca. Metodi per la determinazione della struttura proteica comprendono raggi X ^21; risonanza magnetica nucleare (NMR) ^{22, 23;} e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ²⁴ a temperature criogeniche, cryoEM. La risoluzione cryoEM ultimamente è stata notevolmente migliorata, principalmente per l'uso di elettroni de direttatectors ^{25, 26.} Le macromolecole vengono esposte in un sottile, ghiaccio vitreo ²⁷ in uno stato quasi native. Tuttavia, a causa del basso contrasto di molecole biologiche, diventano difficili da individuare nella gamma di dimensioni 100 – 200 kDa. Per i campioni di dimensioni opportune, raccolta dei dati può essere fatta e il metodo di ricostruzione singola particella può essere applicato per ottenere una struttura ^28.

Tuttavia, la determinazione della struttura delle proteine ​​mediante TEM è un processo a più fasi. Di solito inizia con la valutazione di monodispersity campione negativo-macchia TEM ²⁹ con sali di metalli pesanti come phosphotungsten (PT) ^{30 31} o uranio. Ricostruzione di un modello a bassa risoluzione della macromolecola macchiato negativamente è di solito fatta e può fornire informazioni importanti sulla struttura molecolare ^29. In parallelo,la raccolta dei dati utilizzando cryoEM può iniziare. Si deve prestare attenzione quando si valutano i dati TEM negativo-macchia per evitare l'errata interpretazione di formazione manufatto. Un particolare manufatto è l'effetto della macchia PT su fosfolipidi e liposomi ^32, con conseguente formazione di lunghe aste somiglianti pile di monete viste dal lato ^33. Tale "rouleau" o "stack" (di seguito indicato come "stack") sono stati osservati nella fase iniziale per HDL ^34, e più tardi anche per nanodiscs ^35.

L'accatastamento e rimodellamento delle membrane possono verificarsi per molte ragioni. Ad esempio, può essere indotta da cofattori come il rame, mostrate da immagini TEM in ammonio molibdato macchia ^36. Una frazione dei lipidi di membrana in liposomi conteneva un gruppo di testa di acido iminodiacetico imitando metallo complessazione da EDTA, impilamento così liposomi dopo l'aggiunta di ioni rame <sfino class = "xref"> 36. Stacking potrebbe anche essere dovuto ad una interazione proteina-proteina mediante una proteina nei o sui doppi strati lipidici (la macchia utilizzato non è menzionato) ^37. La formazione pila di fosfolipidi da PT è stato osservato nella fase iniziale; Tuttavia, il lavoro in seguito si è concentrata sulla rimozione o abolire questa formazione artefatto ^38.

Qui, vi proponiamo un metodo per sfruttare la nanodisc NAPT indotto accatastamento per lo studio delle proteine ​​di membrana-binding da TEM. In breve, vincolante per le proteine ​​nanodiscs impedirebbe i nanodiscs da accatastamento. Sebbene le ragioni per l'impilamento non sono chiari, è stato proposto ³⁹ che vi è una interazione elettrostatica tra i fosfolipidi e il gruppo fosforile di PT, causando i dischi di aderire l'uno all'altro (Figura 1A). L'ipotesi dietro il nostro protocollo è che quando una proteina si lega ad un nanodisc, la maggior parte della superficie fosfolipide non è dispo BLE per l'interazione con il terminale a causa dell'impedimento sterico dalla proteina. Ciò impedisce la formazione di stack (Figura 1B). Due conclusioni possono essere tratte. In primo luogo, la prevenzione di impilamento significa che la proteina di interesse è legato alla membrana. In secondo luogo, il complesso proteina-ND può essere trattato con metodi di lavorazione singola particella standard di ^{24, 40} per ottenere una morfologia ruvida del complesso. Inoltre, le analisi con metodi come non-denaturazione elettroforesi su gel o dispersione della luce dinamica può essere eseguita.

Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo utilizzato la proteina di membrana-binding 5-lipossigenasi (5LO), che è coinvolto in molte malattie infiammatorie ^{41, 42.} Questa proteina 78-kDa richiede ioni di calcio di legarsi alla sua membrana ^43. Anche se questa associazione membrana è stata ampiamente studiata utilizzando liposomis = "xref"> ^{44, 45, 46} e frazioni di membrana ^47, questi non possono essere utilizzati per l'analisi TEM e determinazione della struttura.

La preparazione di nanodiscs inizia MSP con lipidi risospese nel colato di sodio detergente miscelazione. Dopo incubazione in ghiaccio per 1 h, il detersivo viene lentamente rimosso dalla miscela ricostituzione con una resina adsorbente. Questo tipo di materiale è spesso realizzato in polistirene forma in piccole perline. Essi sono relativamente idrofobo e hanno una forte preferenza per il detersivo vincolante rispetto ai lipidi ^48. Dopo aver rimosso le perline idrofobiche e l'esecuzione di un chiarimento mediante centrifugazione, i nanodiscs sono purificati mediante cromatografia dimensione esclusione (SEC). I nanodiscs purificati vengono miscelati con una proteina di membrana monotopic (ed eventuali cofattori) in rapporto equimolare (o più rapporti per una titolazione) e sono lasciate rEACT (15 min). Analisi mediante TEM viene effettuata applicando microlitri-quantità di campione attraverso, griglie di carbonio rivestiti bagliore scarica e poi effettuando colorazione negativa con NAPT. Lo stesso campione da cui le aliquote sono state applicate alle griglie TEM può essere utilizzato per l'analisi non-denaturazione o SDS PAGE gel elettroforesi, nonché da vari tipi di misure di attività, con grandi cambiamenti.

Protocol

1. Preparazione di Nanodiscs Espressione e purificazione della proteina di membrana ponteggio 8, 35 Esprimere il MSP1E3D1 His-tag nel E. coli BL21 (DE3) ceppo T1R pRARE2 in fiaschi. Preparare una coltura starter durante la notte da 50 ml con terreno LB integrato con 50 mg / ml kanamicina a 37 ° C. Diluire la coltura starter durante la notte in 2 litri di brodo di medio formidabile integrato con 50 mg / ml kanamicina. Cresc…

Representative Results

Il metodo proponiamo dipende dalla preparazione di nanodiscs per fornire la superficie della membrana per il legame monotopic membrana proteine. Poiché non esiste una proteina transmembrana integrato nel doppio strato lipidico nanodisc, i nanodiscs sono qui indicati come "nanodiscs vuoti" (Figura 2A). Questi hanno un peso molecolare calcolato di 256 kDa per una composizione di due proteine MSP1E3D1 ponteggi e circa 260 molecole di POPC 8.</su…

Discussion

Il metodo può essere suddiviso in tre parti: la ricostituzione di nanodiscs vuoti, la preparazione di complessi proteina-nanodisc, e la colorazione negativa per il TEM di questi complessi. Ogni parte sarà affrontata separatamente per quanto riguarda i limiti della tecnica, passaggi critici, e le modifiche utili.

Ricostituzione di nanodiscs vuote. passaggi critici e limitazioni nella produzione e l'uso di nanodiscs.

Per la preparazione dei nanodiscs vuoti, è e…

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium