Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

Na pesquisa médica, muita atenção está focada em proteínas de membrana, quer intrínsecos ou extrínsecos, envolvidos em uma variedade de interações lipídicas. Trabalhando com proteínas interactuantes de lípidos inclui quer seleccionando um substituto para os lípidos, tais como detergentes, amphipols ^1, ou ² pequenas proteínas, ou encontrar um substituto membrana que mantém a proteína solúvel e activa. Substitutos de membrana lipóico incluem lipossomas e nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs são plataformas de membrana de quase-nativos desenvolvidos por engenharia a parte de proteína, ApoA-1, da lipoproteína de alta densidade (HDL) no sangue que ocorrem naturalmente. ApoA-1 é um resíduo 243 ao longo da cadeia de curtas hélices a anfipáticas e tem uma conformação solúvel livre de lípidos. In vitro, quando na presença de lípidos, duas cópias da proteína de ApoA-1 espontaneamente rearranjar para rodear o hidrporção da cadeia acil ophobic de um lipídico remendo bicamada ^5. versões modificadas de ApoA-1 são geralmente chamadas proteínas de membrana de andaime (MSP), e um número crescente estão comercialmente disponíveis como plasmídeos ou como proteínas purificadas. Repetições ou deleções das hélices em ApoA-1 resultam em proteínas de membrana de andaimes ^{7 6} mais longos ou mais curtos. Isto por sua vez faz com que seja possível formar discos de cerca de 6 nm ⁷ a 17 nm de diâmetro ^8. Existem diferentes tipos de aplicações para o nanodiscs ^{3, 9.} A aplicação mais vulgarmente utilizado é o de proporcionar um ambiente de membrana quase nativo para a estabilização de uma proteína de membrana integral ^8, avaliação previamente ^{3, 9.} Uma utilização menos explorado é proporcionar uma superfície de membrana para o estudo nanoescala demembrana periférica proteínas ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Seção 1 do protocolo abaixo visualiza o procedimento para fazer nanodiscs compostos de fosfolipídios e proteínas andaimes membrana.

A preparação da amostra é um gargalo na maioria dos métodos. amostras específicos do método pode adicionar informações particular, mas também fazer comparações de resultados difícil. Portanto, é mais simples quando as amostras são multimodais e pode ser utilizado directamente em vários métodos diferentes. Uma vantagem com a utilização de nanodiscs é o tamanho pequeno do nanodisc em comparação com lipossomas (por exemplo, as amostras podem ser utilizados directamente para ambos TEM e electroforese em gel não desnaturante, tal como no presente protocolo).

<p class = "jove_content"> vesículas e lipossomas têm sido muito utilizados para compreender a função de proteínas que interagem com membrana. Para os estudos estruturais e de visualização, um exemplo da determinação estrutural de uma proteína transmembranar em lipossomas está disponível ^18. No entanto, nenhuma estrutura 3D de alta resolução de uma proteína de membrana monotópico incorporado em uma membrana de lipossoma ainda não foi publicada, tanto quanto sabemos. As nanopartículas de ouro ou anticorpos pode ser utilizada para visualizar as proteínas de ligação a lipossomas ou vesículas usar o sistema ^19. Mesmo que estas sondas são muito específicos, eles podem interferir com as proteínas de ligação membrana velando o local de ligação da membrana ou mascarando áreas de interesse com as partes flexíveis. Ouro-marcado ou proteínas complexado com anticorpo poderia provavelmente ser analisados ​​num gel, mas isto iria aumentar o custo do experimento.

Embora lipossomas são uma excelente plataforma, não se pode ter certeza de que o popmento tem uma razão particular de proteína por lipossoma, uma característica que pode ser explorado pela utilização de nanodiscs ^20. Em um lipossoma, cofactores e substratos pode ser preso no interior solúvel. Substâncias que são membrana solúvel irá compartilhar o mesmo destino para os dois tipos de miméticos de membranas. No entanto, como a área de bicamada é menor em nanodiscs, uma quantidade menor de substância é necessária para saturar as membranas nanodisc.

a função da proteína compreensão através da determinação da estrutura atômica tem sido essencial para muitos campos de pesquisa. Os métodos para determinação de estruturas de proteínas incluem raios X ^21; ressonância magnética nuclear (RMN) ^{de 22, 23;} e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ²⁴ em temperaturas criogênicas, cryoEM. A resolução por cryoEM ultimamente tem sido muito melhorada, principalmente devido ao uso de elétrons de diretaTectors ^{25, 26.} As macromoléculas são gravadas em fina, gelo vítreo ²⁷ em um estado quase nativo. No entanto, devido ao baixo contraste de moléculas biológicas, tornam-se difíceis de detectar na gama de tamanhos de 100-200 kDa. Para as amostras de tamanho adequado, recolha de dados pode ser feita, e o método de reconstrução única partícula pode ser aplicado para se obter uma estrutura ^28.

No entanto, a determinação da estrutura da proteína por MET é um processo de múltiplos passos. Geralmente começa com a avaliação de monodispersity amostra por-coloração negativa TEM ²⁹ usando sais de metais pesados como phosphotungsten (PT) ³⁰ ou urânio ^31. Reconstrução de um modelo de baixa resolução da macromolécula negativamente corada é geralmente feito e pode fornecer informações importantes sobre a estrutura molecular ^29. Em paralelo,recolha de dados usando cryoEM pode começar. Cuidados devem ser tomados quando se avaliam dados TEM-mancha negativa para evitar a má interpretação da formação de artefato. Um artefacto particular é o efeito da mancha PT em fosfolípidos e lipos somas ^{de 32,} resultando na formação de longas hastes que se assemelham a pilhas de moedas visto de lado ^33. Tal "rouleau" ou "pilhas" (doravante denominada como "pilhas") foram observados no início de HDL ^34, e mais tarde também para nanodiscs ^35.

O empilhamento e reformulação das membranas pode ocorrer por várias razões. Por exemplo, pode ser induzida por co-factores, como o cobre, mostrado por imagem TEM de uma mancha de molibdato de amónio ^36. Uma fracção dos lípidos de membrana em liposomas continha um grupo de cabeça de ácido iminodiacético imitando complexação de metais por EDTA, empilhamento, portanto, os lipossomas após a adição de iões de cobre <s-se class = "xref"> 36. Empilhamento também poderia ser devido a uma interacção proteína-proteína através de uma proteína dentro ou sobre as bicamadas lipídicas (a mancha utilizado não é mencionado) ^37. A formação da pilha de fosfolípidos por PT foi observada desde o início; no entanto, trabalho posterior tem incidido sobre a remoção ou abolir esta formação artefato ^38.

Aqui, propõe-se um método para aproveitar a nanodisc induzida napt empilhamento para o estudo de proteínas de ligação de membrana por TEM. Em suma, obrigatória para as nanodiscs proteína impediria os nanodiscs de empilhamento. Embora as razões para o empilhamento não são claros, foi proposto que ³⁹ existe uma interacção electrostática entre os fosfolípidos e o grupo fosforilo da PT, fazendo com que os discos adiram uns aos outros (Figura 1A). A hipótese atrás nosso protocolo é que quando uma proteína se liga a um nanodisc, a maior parte da superfície de fosfolípido não é disponí ble para a interacção com o PT devido a impedimento estérico da proteína. Isto iria evitar a formação da pilha (Figura 1B). Duas conclusões podem ser tiradas. Em primeiro lugar, a prevenção de empilhamento significa que a proteína de interesse está ligado à membrana. Em segundo lugar, o complexo proteína-ND pode ser tratado com os métodos de processamento de uma única partícula padrão ^{24, 40} para obter uma morfologia grosseira do complexo. Além disso, as análises por métodos tais como a electroforese em gel não desnaturante ou dispersão dinâmica da luz pode ser realizado.

Para demonstrar esta hipótese, utilizou-se a proteína de ligação à membrana de 5-lipoxigenase (5LO), que está envolvida em muitas doenças ^{inflamatórias, 41 42.} Esta proteína de 78 kDa requer iões de cálcio para se ligar à sua membrana ^43. Embora esta associação membrana tem sido estudada extensivamente utilizando lipossomass = "refex"> ^{44, 45, 46} e ⁴⁷ fracções de membrana, estes não podem ser utilizados para a análise TEM e determinação da estrutura.

A preparação de nanodiscs começa por mistura com lípidos MSP ressuspensas no detergente colato de sódio. Após incubação em gelo durante 1 h, o detergente é lentamente removido da mistura reconstituição utilizando uma resina adsorvente. Este tipo de material é frequentemente feito de poliestireno moldado em pequenos grânulos. Eles são relativamente hidrofóbico e têm uma forte preferência para o detergente de ligação em comparação com lipídeos ^48. Depois de remover as pérolas hidrofóbicas e realizando clarificação com centrifugação, os nanodiscs são purificados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Os nanodiscs purificadas são misturados com uma proteína de membrana monotópico (e possíveis cofactores) em uma proporção equimolar (ou várias proporções para uma titulação) e são deixados a react (15 min). A análise por TEM é levada a cabo aplicando-ul quantidades de amostra em, grelhas revestidas de carbono têm um brilho descarregada e, em seguida, através da realização de coloração negativa com napt. A mesma amostra de quando as alíquotas foram aplicadas às grades de MET pode ser utilizado para análise por não desnaturante ou SDS-PAGE electroforese em gel, bem como por vários tipos de medições da actividade, sem grandes alterações.

Protocol

1. Preparação de Nanodiscs Expressão e purificação da proteína de membrana de andaimes 8, 35 Expressar a MSP1E3D1 marcada com His no coli BL21 E. (DE3) estirpe T1R pRARE2 em frascos. Prepara-se uma cultura de arranque durante a noite de 50 ml com meio LB suplementado com 50 ug / ml de canamicina a 37 ° C. Dilui-se a cultura de arranque durante a noite em 2 L de meio de caldo óptimo suplementado com 50 ug / ml de cana…

Representative Results

O método é proposto depende da preparação de nanodiscs para proporcionar a superfície da membrana para a ligação monotópico membrana-proteína. Como não há nenhuma proteína transmembranar incorporado na bicamada lipídica nanodisc, os nanodiscs são aqui indicadas como "nanodiscs vazias" (Figura 2A). Estes têm um peso molecular calculado de 256 kDa para uma composição de duas proteínas MSP1E3D1 andaimes e cerca de 260 moléculas de POPC <sup clas…

Discussion

O método pode ser dividido em três partes: a reconstituição de nanodiscs vazio, a preparação de complexos de proteína-nanodisc, e a coloração negativa para a ETM destes complexos. Cada parte será tratado separadamente sobre limitações da técnica, passos críticos, e as modificações úteis.

Reconstituição de nanodiscs vazios. passos e limitações críticas na produção e utilização de nanodiscs.

Para a preparação dos nanodiscs vazias, que é es…

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium