Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

I medicinsk forskning, är mycket uppmärksamhet inriktad på membranproteiner, antingen inneboende eller yttre, deltar i en mängd olika lipid interaktioner. Att arbeta med lipid-interagerande proteiner innefattar att antingen välja ett substitut för de lipider, såsom detergenter, amphipols ^1, eller små proteiner ^2, eller att hitta ett membran substitut som håller proteinet lösligt och aktivt. Lipoic membran substitut inkluderar liposomer och nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs är nära främmande membranplattformar som utvecklats av ingenjörsproteindelen, ApoA-1, i high-density lipoprotein (HDL) finns naturligt i blodet. ApoA-1 är en 243 rest-lång kedja av korta amfipatiska a-helixar och har en lipid-fritt löslig konformation. In vitro i närvaro av lipider, två kopior av proteinet ApoA-1 spontant ordna att omringa hydrophobic acylkedja parti av ett lipiddubbelskikt patch ^5. Manipulerade versioner av ApoA-1 kallas allmänt membran byggnadsställningar proteiner (MSP), och ett ökande antal är kommersiellt tillgängliga som plasmider eller som renade proteiner. Upprepningar eller deletioner av de a-helixar i ApoA-1 resulterar i längre ⁶ eller kortare ⁷ membran byggnadsställningar proteiner. Detta i sin tur gör det möjligt att bilda skivor runt 6 nm ^7-17 nm ^åtta i diameter. Det finns olika typer av applikationer för nanodiscs ^{3, 9.} Det mest använda ansökan är att tillhandahålla en nästan infödda membranmiljö för stabilisering av ett integralt membranprotein ^8, tidigare ^{3, 9} över. En mindre utforskas användning är att tillhandahålla en nanoskala membranyta för studier avperifert membranprotein ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Avsnitt 1 i protokollet nedan visualiserar förfarandet för nanodiscs bestående av fosfolipider och membran byggnadsställningar protein.

Provberedning är en flaskhals i de flesta metoder. Metod specifika prover kan lägga särskild information, men de också göra jämförelser av resultaten svårt. Därför är det enklare när proverna är multimodala och kan användas direkt i ett flertal olika metoder. En fördel med användningen av nanodiscs är den lilla storleken på nanodisc i jämförelse med liposomer (t.ex., kan proverna direkt användas för både TEM och icke-denaturerande gelelektrofores, såsom i föreliggande protokoll).

<p class = "jove_content"> Blåsor och liposomer har länge använts för att förstå funktionen hos membraninteragerande proteiner. För strukturella studier och visualisering, är ett exempel på strukturbestämning av ett transmembranprotein i liposomer tillgängliga ^18. Emellertid har ingen hög upplösning 3D-strukturen för en monotopic membranprotein inbäddade på en liposommembranet publicerad ännu, så vitt vi vet. Guld nanopartiklar eller antikroppar kan användas för att visualisera proteinerna binder till liposomer eller vesiklar med hjälp av TEM ^19. Även om dessa prober är mycket specifika, kan de störa membranbindande proteiner genom döljande membranet bindningsstället eller genom att maskera intresseområden med de flexibla delarna. Guldmärkt eller antikroppskomplex proteiner skulle förmodligen kunna analyseras på en gel, men detta skulle öka kostnaden för experimentet.

Även liposomer är en utmärkt plattform, kan man inte vara säker på att poplering har ett speciellt förhållande av protein per liposom, en funktion som kan utforskas med hjälp av nanodiscs ^20. I en liposom, kan kofaktorer och substrat vara instängd i den lösliga inre. Ämnen som är membranlösliga kommer att dela samma öde för båda typerna av membran mimetika. Icke desto mindre, eftersom dubbelskiktet arean är mindre i nanodiscs, är en mindre mängd substans som krävs för att mätta de nanodisc membranen.

Förståelse proteinfunktion genom fastställandet av den atomära strukturen har varit avgörande för många forskningsområden. Metoder för proteinstrukturbestämning inkluderar röntgen ^21; kärnmagnetisk resonans (NMR) ^{22, 23;} och transmissionselektronmikroskopi (TEM) ²⁴ vid kryogena temperaturer, cryoEM. Upplösningen av cryoEM har på senare tid förbättrats avsevärt, främst på grund av användningen av direkt elektron detectors ^{25, 26.} Makromolekylerna avbildas i tunn, glaskroppen is ²⁷ i en nära-naturliga tillstånd. Men på grund av den låga kontrasten av biologiska molekyler, de blir svåra att upptäcka i storleksområdet på 100 – 200 kDa. För lämplig storlek prover, kan datainsamlingen göras och förfarandet för enda partikel återuppbyggnad kan tillämpas för att erhålla en struktur ^28.

Emellertid är bestämningen av proteinstrukturen med TEM en flerstegsprocess. Det börjar oftast med utvärderingen av prov monodispersitet av negativ fläck TEM ²⁹ användning av salter av tungmetaller som phosphotungsten (PT) ³⁰ eller uran ^31. Rekonstruktion av en lågupplöst modell av negativt färgad makromolekyl är vanligtvis gjord och kan ge viktig information om den molekylära strukturen ^29. Parallellt,datainsamling med hjälp av cryoEM kan börja. Försiktighet bör iakttas vid bedömningen negativ fläck TEM uppgifter för att undvika feltolkning av artefakt bildning. En särskild artefakt är effekten av PT fläck på fosfolipider och liposomer ^32, vilket resulterar i bildandet av långa stavar liknar staplar av sedd från sidan ³³ mynt. Sådana "rouleau" eller "stackar" (nedan betecknade som "stackar") observerades tidigt för HDL ^34, och senare även för nanodiscs ^35.

Stapling och omformning av membran kan uppstå av många anledningar. Till exempel kan den framkallas genom co-faktorer som koppar, som visas av TEM avbildning i en ammoniummolybdat fläcken ^36. En fraktion av de membranlipider i liposomer innehöll en iminodiättiksyra huvudgrupp mimicking metallkomplexbildning genom EDTA, således stapling liposomer efter tillsatsen av kopparjoner <supp class = "xref"> 36. Stapling kan också vara på grund av en protein-proteininteraktion av ett protein i eller på lipidbiskikten (är fläcken används nämns inte) ^37. Stapeln bildandet av fosfolipider av PT iakttogs tidigt; har dock senare arbete inriktat på att avlägsna eller avskaffa denna artefakt bildning ^38.

Här föreslår vi en metod för att dra nytta av NAPT-inducerad nanodisc stapling för att studera membranbindande proteiner genom TEM. Kort sagt, skulle proteinbindning på nanodiscs hindra nanodiscs från stapling. Även om orsakerna för stapling är inte klart, föreslogs det ³⁹ att det finns en elektrostatisk interaktion mellan fosfolipider och den fosforylgruppen av PT, vilket orsakar att skivorna att hålla sig till varandra (Figur 1A). Hypotesen bakom våra protokoll är att när ett protein binds till en nanodisc, är de flesta av de fosfolipidyta inte availa ble för interaktionen med PT på grund av steriskt hinder av proteinet. Detta skulle förhindra bunten bildning (Figur 1B). Två slutsatser kan dras. Först, förhindrande av stapling innebär att proteinet av intresse har bundit till membranet. För det andra kan det protein-ND-komplexet behandlas med standardenkelpartikelbearbetningsmetoder ^{24, 40} för att få en grov morfologi av komplexet. Vidare analyser medelst metoder som icke-denaturerande gelelektrofores eller dynamisk ljusspridning kan utföras.

För att visa denna hypotes använde vi membranbindande protein 5-lipoxygenas (5LO), som är involverat i många inflammatoriska sjukdomar ^{41, 42.} Detta protein 78-kDa kräver kalciumjoner för att binda till dess membran ^43. Även om detta membran förening har studerats i stor utsträckning med hjälp av liposomers = "xref"> ^{44, 45, 46} och membranfraktioner ^47, dessa kan inte användas för TEM-analys och strukturbestämning.

Framställningen av nanodiscs börjar genom att blanda MSP med lipid suspenderades i tvättmedels natriumcholat. Efter inkubation på is under 1 h, detergenten avlägsnas långsamt från rekonstituering blandningen med användning av en adsorbent-harts. Denna typ av material är ofta gjorda av polystyren formas till små pärlor. De är relativt hydrofoba och har en stark preferens för att binda rengöringsmedel jämfört med lipider ^48. Efter avlägsnande av de hydrofoba kulorna och utföra förtydligande med hjälp av centrifugering, är de nanodiscs renades genom storleksuteslutande kromatografi (SEC). De renade nanodiscs är blandade med en monotopic membranprotein (och eventuella kofaktorer) i ett ekvimolärt förhållande (eller flera förhållanden för en titrering) och lämnas att rEACT (15 min). Analys med TEM utförs av mikroliter-mängder prov applicering på glöd-urladdat, kolbelagda galler och sedan genom att utföra negativ färgning med NAPT. Samma prov från det att alikvoter applicerades på TEM galler kan användas för analys av icke-denaturering eller SDS PAGE-gel-elektrofores, samt av olika typer av aktivitetsmätningar, utan större förändringar.

Protocol

1. Framställning av Nanodiscs Expression och rening av membran byggnadsställningar protein 8, 35 Uttrycka den His-märkt MSP1E3D1 i E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stammen i kolvar. Bered en 50-ml över natt-startkultur med LB-medium kompletterat med 50 | ig / ml kanamycin vid 37 ° C. Späd över natt-startkultur i 2 L av Terrific Broth-medium kompletterat med 50 | ig / ml kanamycin. Odla cellerna vid 37 ° C tills den opt…

Representative Results

Den metod vi föreslår beror på framställningen av nanodiscs att åstadkomma membranytan för monotopic membranproteinbindning. Eftersom det inte finns någon transmembranprotein inbäddade i nanodisc lipiddubbelskiktet, är nanodiscs här betecknad som "tomma nanodiscs" (Figur 2A). Dessa har en beräknad molekylvikt på 256 kDa för en sammansättning av två MSP1E3D1 byggnadsställningar proteiner och omkring 260 molekyler av POPC 8.</sup…

Discussion

Metoden kan separeras i tre delar: den rekonstitution av tomma nanodiscs, framställning av protein-nanodisc komplex, och negativ färgning för TEM av dessa komplex. Varje del kommer att behandlas separat när det gäller begränsningar av tekniken, kritiska steg, och användbara modifieringar.

Beredning av tomma nanodiscs. Kritiska steg och begränsningar i produktionen och användningen av nanodiscs.

För framställningen av de tomma nanodiscs, är det viktigt at…

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium