Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

Summary

Este protocolo descreve a produção de um anticorpo terapêutico num sistema de expressão de mamífero. Os métodos descritos incluem a preparação de ADN do vector, transfecção estável e adaptação isento de soro de uma linha celular de rim embrionário humano 293, configurado de culturas em larga escala e a purificação utilizando cromatografia de afinidade.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

O sucesso de anticorpos terapêuticos continua a impulsionar o investimento substancial no desenvolvimento de anticorpos como uma onda de terapêuticas próxima geração começa. O mercado de anticorpo deverá ser remodelada por fragmentos de anticorpos ^1, conjugados de anticorpos ^droga-2, anticorpos biespecíficos ³ e anticorpos modificados com propriedades favoráveis ^4. Outra classe ganhando interesse farmacêutico são biossimilares. anticorpos biossimilares são "altamente semelhantes" replicar produtos de um anticorpo terapêutico que já recebeu aprovação regulatória. A biossimilar proposto deve ser comparável com o anticorpo originador no que diz respeito à sua estrutura, função, toxicidade animal, a segurança clínica e eficácia, farmacocinética humana (PK), farmacodinâmica (PD) e imunogenicidade ^{5, 6.}

A aprovação rates de anticorpos biossimilares têm sido lentos devido às limitações estritas sobre a qualidade final do produto. Os processos de fabrico exactas, tais como linhas de células e condições de cultura específica através dos passos de processamento finais podem permanecer proprietária. O que é mais, a produção de anticorpos envolve inerentemente um grau de variabilidade que pode adicionar ao desafio de produzir um produto altamente semelhantes. A caracterização e comparação físico-química e biofísica abrangente é bastante difícil, mas uma série de estudos que demonstram as características dos anticorpos biossimilares estão surgindo na literatura ^{7, 8, 9.}

Geração de um anticorpo terapêutico começa com a transfecção de células hospedeiras de mamífero com um vector portador de genes para o respectivo anticorpo. projeto do vetor, as condições da linha celular e cultura são aspectos fundamentais para configurar o exsistema de pressão.

As sequências de DNA de anticorpos podem ser provenientes de Drogas Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou publicações de pesquisa, incluindo patentes. Por exemplo, a sequência de trastuzumab está disponível através da droga Bank (DB ID: DB00072). A sequência de aminoácidos das regiões variáveis ​​podem ser submetidos a concepção do gene e a optimização para a síntese nas espécies hospedeiras desejadas. É importante para um anticorpo biológico similar que nenhuma modificação é feita com a sequência de aminoácidos. Uma vez sintetizados, os genes de anticorpo pode ser subclonado no vector apropriado de escolha.

anticorpos IgG humana consistem de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Expressão fortemente regulada de ambas as cadeias é essencial para a produção óptima de proteína IgG heterólogo em células de mamífero ^10. Intra-, bem como ligações dissulfureto inter-cadeias tem que ser formado e uma série de modificações pós-tradução tem que estar emtroduced durante a biossíntese da proteína. Uma série de vectores estão disponíveis, que foram especificamente concebidos para expressar genes de anticorpos (consultar a Tabela de Materiais). Estes vectores específicos de anticorpos normalmente expressam as regiões constantes para ambas as cadeias pesada e leve de modo que apenas as regiões variáveis ​​de cada cadeia requerem clonagem.

A transfecção de células com duas construções independentes (co-transfecção), é a abordagem mais comum para a libertação de genes pesada e leve que codifica cadeia. Isto é, cada gene é conduzido pelo seu próprio promotor e transcrito como cadeias de anticorpo separadas antes de serem montadas no retículo endoplasmático. Por outro lado, os vectores multi-cistrónico têm elementos internos local de entrada de ribossoma (IRES) incorporados que permitem a expressão de múltiplos genes como um único transcrito de ARNm com tradução permitida a partir de regiões internas do ARNm ^11. Neste exemplo, as pesadas e leves genes codificadores da cadeia são acoplados numa Arrangement para conseguir a co-expressão de ambas as cadeias de anticorpos ^{10, 12.}

Enquanto as células transfectadas transientemente produzir proteína suficiente para executar um número limitado de experiências, as linhas celulares transfectadas de forma estável que tenham sido submetidos a selecção para a integração do genoma pode proporcionar rendimentos mais elevados. Quantidades de proteína mais elevado para permitir que o desenvolvimento do ensaio, relativa a caracterização in vitro e pode proporcionar uma indicação da qualidade de anticorpos em consideração para aplicações a jusante, tais como a linha celular clonal e selecção de candidatos de chumbo.

O objetivo deste artigo é descrever a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico produzido num sistema de expressão de mamífero. Com efeito, este método pode ser aplicado para a expressão de um anticorpo biológico similar. O método pode ser utilizado para a caracterização inicial de anticorpos, antes de prosseguir para o crítico, embora ste demoradops de identificar um clone desejável para o fabrico de maior escala. Além disso, este método pode ser utilizado para expressar proteínas e outros não apenas anticorpos.

O protocolo detalhado seguinte descreve a expressão do anticorpo trastuzumab terapêutica. Esta consiste na preparação de DNA do vector seguido por transfecção estável na linha celular HEK-293 e a purificação da proteína do anticorpo por um método de cromatografia automatizado.

Protocol

NOTA: Um vector de expressão de mamífero adequado deve ser utilizado para este protocolo. Aqui, uma única construção que contém duas cassetes de expressão é utilizado (isto é, expressão da cadeia pesada e leve é conduzida por promotores separados). Trastuzumab cadeias pesadas e leves foram previamente clonado no vector. Este vector foi um presente de Andrew Beavil, obtido através de um lucro não-para-repositório plasmídeo 13. 1. Recuperação e scale-up de DNA Vector…

Representative Results

Produção estável de trastuzumab por células HEK-293 transfectadas foi confirmada utilizando interferometria-camada de bio (BLI), como apresentado na Figura 1. Uma curva padrão de IgG foi gerado através da medição da taxa de ligação entre um padrão de anticorpos IgG e proteína A biossensor (Figura 1A). A amostra de sobrenadante em bruto foi medida de modo análogo, em seguida, a sua concentração interpolada a partir da curva padrão …

Discussion

Este protocolo detalha a transfecção, a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico em células HEK-293. A expressão estável de genes de anticorpo é o primeiro passo na geração de uma linha de células produtoras de anticorpo para o desenvolvimento e a fabricação de um anticorpo terapêutico. Enquanto ovário de hamster chinês (CHO) continuam a plataforma de escolha para proteínas terapêuticas expressão, a linha de células HEK-293 está a ganhar proeminência com a percepção de que…

Materials

pFUSE vector series	N/A	InvivoGen	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	N/A	Lonza	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	61883	Addgene	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	fas-hg-s	Jomar Life Research	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	fas-hg-l	Jomar Life Research	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	G6279	Sigma-Aldrich	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	G221020	Astral Scientific	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	R790-07	Life Technologies	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	12338-018	Life Technologies	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
DMEM, high glucose	11995-065	Life Technologies
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	10082-147	Life Technologies
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	23966	Polysciences, Inc.	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use.
OptiPro SFM	12309-050	Life Technologies	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	ant-hg-1	Jomar Life Research
Dimethylsulphoxide (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
Tryptone (casein peptone)	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	09-2051-100	Astral Scientific
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	GE17-0403-01	Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100	28406266	GE Healthcare	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	G2879	Sigma-Aldrich
Citric Acid, monohydrate	BIOC2123	Astral Scientific
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	BIOCB0035	Astral Scientific
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	BIOSD8146	Astral Scientific
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	UFC803008/UFC903008	Merck Millipore	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	23227	Thermo Fisher Scientific
BLItz System	45-5000	fortéBIO	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	18-5010	fortéBIO
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	786-502	Astral Scientific
Ammonium Persulfate (APS)	AM0486	Astral Scientific
TEMED	AM0761	Astral Scientific
Coomassie Brilliant Blue R-250	786-498	Astral Scientific
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	1610374	Bio-Rad