Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması
Summary
Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.
Abstract
Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.
Introduction
terapötik antikorların başarılı nesil terapötik bir dalga başlar Antikor gelişme içine önemli miktarda yatırım sürmeye devam eder. Antikor pazar uygun özelliklere 4 antikor fragmanları 1, antikor-ilaç konjugatlarının 2 bispesifik antikorlar 3 ve işlenmiş antikorlar suretiyle yeniden beklenmektedir. İlaç ilgi kazanıyor başka sınıf biyobenzerler vardır. Biyobenzer antikorlar zaten düzenleyici onayı almış bir terapötik antikorun ürünlerini çoğaltmak 'son derece benzer'. Önerilen bir Biyobenzer yapısı, fonksiyon, hayvan toksisite, klinik güvenlik ve etkinliği, insan farmakokinetik (PK), farmakodinamik (PD) ve immünojenite 5, 6 ile ilgili olarak yaratıcısı antikoru ile uyumlu olmalıdır.
onay rBiyobenzer antikorların ates nedeniyle ürünün nihai kalitesi üzerinde sıkı kısıtlamalar yavaş olmuştur. Böyle son işlem adımlarına yoluyla hücre hatları ve kültürleme koşulları belirli tam olarak üretim süreçlerinin tescilli kalabilir. Dahası, antikor üretimi doğal oldukça benzer bir ürün üretme meydan ekleyebileceğiniz değişkenlik derecesi gerektirir. Kapsamlı bir fizikokimyasal ve biyofizik karakterizasyonu ve karşılaştırma oldukça zordur, ancak Biyobenzer antikorların özelliklerini gösteren bir dizi çalışma literatürde 7, 8, 9 ortaya çıkıyor.
terapötik bir antikor üretme ilgili antikor için geni taşıyan bir vektör ile memeli konakçı hücrelerinin transfeksiyonu ile başlar. Vektör tasarımı, hücre dizisi ve kültür koşulları eski kurmak için anahtar faktörlerdirpression sistemi.
antikorların DNA dizileri İlaç Bankası (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ya da patent dahil olmak üzere araştırma yayınlarından kaynaklı olabilir. Örneğin, trastuzumab sırası İlaç Bankası (: DB00072 DB ID) aracılığıyla kullanılabilir. değişken bölgelerinin amino asit dizisi istenen konakçı türlerinde sentezi için gen tasarımı ve optimizasyonu geçirebilmektedir. Bu hiçbir değişiklik amino asit sekansına yapılan bir biyobenzer antikor için önemlidir. sentezlenmiş sonra, antikor genleri seçim uygun bir vektör içine alt klonlanabilir.
İnsan IgG antikorları iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincirlerin oluşur. Her iki zincir sıkı bir biçimde düzenlenmesi sentezleme memeli hücrelerinde 10 heterolog IgG proteini optimal üretimi için gereklidir. arası zincirli disülfid bağının oluşmaması gerekir ve post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi olması hem de İçiprotein biyosentezi sırasında troduced. vektörlerin bir dizi antikor genleri (Malzeme Tablo bakın) ifade etmek için özel olarak tasarlanmış olduğunu mevcuttur. Bu antikor özel vektörler, genellikle, her zincirin bu nedenle sadece değişken bölgeleri klonlama gerektirir ağır hem de hafif zincirlerin sabit bölgeleri ifade eder.
iki bağımsız yapıların (ko-transfeksiyon) ile hücrelerin transfeksiyonu, ağır ve hafif zincir kodlayan genlerin verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Başka bir deyişle, her bir genin endoplazmik retikulum içinde birleştirilmeden önce, kendi promoter tarafından tahrik edilen ve ayrı antikor zincirleri olarak transkripsiyonu. Diğer taraftan, çoklu-sistronik vektörler mRNA 11 iç bölgelerinden izin çeviri ile tek bir mRNA transkripti olarak birden fazla genin ifadesini izin dahil dahili ribozom giriş sahası (IRES) elemanları vardır. Bu durumda, ağır ve hafif zincir kodlayan genler arrang bağlanmış olanHer iki antikor zincirlerinin 10, 12 eş ifadesini elde etmek için ası,.
geçici olarak transfekte hücreler, deney sınırlı sayıda gerçekleştirmek için yeterli protein elde birlikte, genom entegrasyonu için seçim geçiren stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatları daha yüksek verim verebilir. Daha yüksek protein miktarlarının in vitro karakterizasyonu ile ilgili deney geliştirme sağlar ve klonal hücre hattı ve kurşun aday seçimi gibi alt uygulamalar dikkate antikor kalitesinin bir göstergesini sağlar.
Bu maddenin amacı, bir memeli ekspresyon sisteminde üretilmiş bir terapötik antikorun kararlı ifadesi ve saflaştırılması tarif etmektir. Gerçekten de, bu yöntem, biyobenzer antikorun ifadesine uygulanabilir. yöntem, zaman alıcı ste olsa önemli için devam etmeden önce, antikorların başlangıç karakterizasyonu için kullanılabilirdaha büyük ölçekli üretimi için bir arzu klon belirleme ps. Dahası, bu yöntem diğer proteinleri ve sadece antikorların ifade edilmesi için kullanılabilir.
Aşağıdaki detaylı protokol terapötik antikor trastuzumab ifadesini açıklar. Bu, otomatik bir kromatografik yöntem ile, HEK-293 hücre hattı ve antikor proteininin saflaştırılmasına kararlı transfeksiyonu takiben vektör DNA'nın hazırlanması oluşur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, HEK-293 hücrelerinde transfeksiyon, stabil ekspresyon ve bir terapötik antikorun saflaştırılması göstermektedir. antikor genlerinin kararlı tanımının, bir terapötik antikorun geliştirilmesi ve üretimi için bir antikor üreten hücre hattı oluşturmak için ilk adımdır. Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinler için tercih edilen sentezleme platformu kalırken, HEK-293 hücre hattı mesaj açısından bu hücrelerde üretilen proteinler, doğal insan proteini olarak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.
Materials
| pFUSE vector series | N/A | InvivoGen | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | N/A | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | N/A | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | 61883 | Addgene | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | fas-hg-s | Jomar Life Research | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | fas-hg-l | Jomar Life Research | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | G6279 | Sigma-Aldrich | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | G221020 | Astral Scientific | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | R790-07 | Life Technologies | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | 12338-018 | Life Technologies | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | K4894 | Sigma-Aldrich | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| DMEM, high glucose | 11995-065 | Life Technologies | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | 10082-147 | Life Technologies | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | 23966 | Polysciences, Inc. | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use. |
| OptiPro SFM | 12309-050 | Life Technologies | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | ant-hg-1 | Jomar Life Research | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | AJA2225 | Thermo Fisher Scientific | |
| Tryptone (casein peptone) | LP0042B | Thermo Fisher Scientific | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | 09-2051-100 | Astral Scientific | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | GE17-0403-01 | Sigma-Aldrich | |
| AKTApurifier 100 | 28406266 | GE Healthcare | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | G2879 | Sigma-Aldrich | |
| Citric Acid, monohydrate | BIOC2123 | Astral Scientific | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | BIOCB0035 | Astral Scientific | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | BIOSD8146 | Astral Scientific | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | UFC803008/UFC903008 | Merck Millipore | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | 23227 | Thermo Fisher Scientific | |
| BLItz System | 45-5000 | fortéBIO | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | 18-5010 | fortéBIO | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | 786-502 | Astral Scientific | |
| Ammonium Persulfate (APS) | AM0486 | Astral Scientific | |
| TEMED | AM0761 | Astral Scientific | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | 786-498 | Astral Scientific | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | 1610374 | Bio-Rad |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- . . Food and Drug Administration. 22, (2015).
- . . European Medicines Agency. 13, (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
