We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.
Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.
Biomineralización es una compleja serie de eventos, que tiende un puente sobre un conjunto de actividades celulares que resultan en la producción de minerales exquisitamente ordenados 1. El reto es caracterizar tanto el proceso celular dinámica y las estructuras minerales sofisticados usando una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica. Una elevación del pH intracelular favorece la formación de CaCO 3 cristales, por lo tanto, la identificación de la etapa de la vida que tiene un mayor pH revela el momento en que es probable que se produce 2, 3 calcificación.
Los gusanos de tubo de la familia Serpulidae son calcificadores comunes en el océano 4. También es un modelo de invertebrados popular para la investigación marina, especialmente en la contaminación biológica 5, 6. En este estudio, el proceso de calcificación en compartimentos mineralizantes Durise observa ng biomineralización. El rápido proceso de metamorfosis incluye la aparición de estructuras de carbonato de calcio 7, 8.
Demostramos cómo las mediciones de pH interno se puede realizar en el tubeworm, y cómo etapas y tejidos relevantes para la calcificación de la vida puede ser examinado. Una vez que se identifica la etapa de desarrollo de interés, el tejido responsable de la calcificación se puede caracterizar con mayor resolución utilizando métodos de microscopía electrónica. El uso de microscopía de fluorescencia, se determina el tiempo requerido para el carbonato de calcio a aparecer después de la inducción metamórficas. Una etapa similar de la vida se visualizó posteriormente con SEM-EDS para la distribución de la composición elemental, y el mineral depositado se analizó utilizando dos métodos diferentes de microscopía electrónica, específicamente SEM-FIB-EBSD y TEM.
formación de imágenes ópticas en vivo es un método útil para la observación de acontecimientos celulares en un organismo multicelular. Aquí, los indicadores de pH y de iones de calcio interno se utilizaron para medir el flujo de iones en los sitios de mineralización. En estas regiones, se requiere el bombeo de iones activo para elevar el pH y la concentración de Ca2 + para permitir la calcificación 2, 3. Cuando la aplicación de las molécul…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).
Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
HRTEM H500 | Hitachi | ||
SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |