L'esame dei fenotipi host in<em> affinis Gambusia</em> In seguito a trattamento antibiotico

Summary

Questo studio coinvolge i metodi per rivelare gli effetti su un host modello di pesce seguito alterazione della pelle e intestino composizione delle comunità microbiome da un antibiotico.

Abstract

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduction

È stato stabilito che gli antibiotici possono disturbare il microbioma umano che porta a disbiosi, il che significa uno squilibrio comunità microbica. Alterazione della composizione del microbiota dopo trattamenti antibiotici ha dimostrato di ridurre la diversità della comunità, di ridurre i membri chiave, e alterare il metabolismo della comunità, in particolare nell'intestino ^{1, 2.} Disturbi antibiotico del microbioma intestinale in grado di ridurre la resistenza colonizzazione da Clostridium difficile ^{3, 4} e ⁵ Salmonella.

Inoltre, l'interruzione del microbiota è stato collegato allo sviluppo di molte sindromi e malattie negli esseri umani (per esempio, associata agli antibiotici enterocolite, malattie infiammatorie intestinali, disturbi metabolici, ecc.). Gli antibiotici sono anche ampiamente implementati in agricoltura come promotori della crescita neibestiame e pollame di produzione ^6. L'utilizzo di questi potenti strumenti non è priva di effetti collaterali, che è evidente nel rapido aumento della resistenza agli antibiotici, così come gli effetti di una microbiome perturbato ha con il suo ospite abitato. Molti studi hanno dimostrato che l'ampio spettro di utilizzo di antibiotici ha lunghe conseguenze durature per la struttura e la funzione del microbiota, eppure gli effetti collaterali da un microbiome impatto fisiologia ospite antibiotico-perturbato sono solo speculazioni, che devono ancora essere supportato.

L'interazione tra host, microbiota, e antibiotici è ben lungi dall'essere inteso in modo conciso. Pertanto, un modello semplice e più trattabile è vantaggioso per illuminare il sistema di mammiferi molto complesso. mucose negli esseri umani, tra cui l'intestino, il porto la più alta densità e la diversità dei microbi, e anche i più intimi interazioni microbo-ospite. Il microbioma pelle mucosa offre pesce svantaggi everal come sistema modello. Il Teleostei (pesci ossei) è uno dei primi lignaggi a divergere ai sensi vertebrati che teleostei hanno sia innato e acquisito un sistema immunitario che sono co-evoluti un rapporto con le comunità batteriche commensali ^7. Azioni pelle di pesce molte caratteristiche con le superfici di tipo 1 mucose di mammiferi, come le funzioni fisiologiche, i componenti di immunità, e la disposizione delle cellule che producono muco ^8. La posizione esterna della superficie cutanea pesci mucosa offre microbiome facile da manipolare sperimentalmente e campione.

Il mosquitofish occidentale, affinis Gambusia affinis (G.), è un pesce modello che è stato usato in passato per lo studio dell'accoppiamento e tossicologia ^{9, 10, 11.} Data la piccola dimensione, numero di esemplari in natura come una specie invasiva, m costi di assistenza inimal, e la natura resistente, abbiamo sviluppato G. affinis come modello microbiome mucosa. Inoltre, Gambusia condividono la fisiologia del parto a vivere i giovani con i mammiferi vivipari, il che è raro in specie di pesci. Abbiamo completato il più ampio studio al momento della pelle di pesce microbiota normale utilizzando 16S profilatura con Gambusia ^12. Ulteriori lavori hanno dimostrato tre effetti negativi sulla serie seguenti interruzione della pelle e flora intestinale con un antibiotico ad ampio spettro ^13.

Cinque diversi effetti sono stati esaminati nel pesce dopo l'esposizione agli antibiotici. Il vantaggio ospite più consolidata del microbioma è esclusione competitiva di agenti patogeni. Il pesce patogeno Edwardsiella ictaluri è noto per provocare focolai di setticemia enterica in allevamenti di pesce gatto commerciali ^14. E. ictaluri è stato anche dimostrato di infettare mortalmente zebrafishclass = "xref"> ^{15, 16} e ¹⁷ Gambusia. Una sfida con questo patogeno dalla colonna d'acqua può servire come una misura di esclusione. Come confronto suscettibilità a un patogeno individuo, la sopravvivenza durante l'esposizione ad alta densità di organismi misti stata inoltre effettuata. Feci e organico ricco suolo sono stati utilizzati come fonti comunemente riscontrate delle comunità microbiche.

Un altro ruolo stabilito la comunità batterica intestinale svolge è l'elaborazione di nutrienti e di energia raccolta, influenzando così l'assorbimento nutrizionale generale per l'host. Come una misura lorda di alimentazione, il peso corporeo del pesce è stato confrontato prima e dopo un mese di essere alimentati con una dieta standard. pesce trattata con antibiotici come media ha perso peso, mentre i pesci di controllo, in media, ha guadagnato peso nel corso del mese. Il meccanismo di questa mancanza di aumento di peso non è chiaro. Una possibile fattore è il tempo di transito del cibo nell'intestino. A Moti GIMetodo lità è stato adattato da zebrafish (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicazione personale) per determinare il tempo di transito. Non è stato ancora determinato se pesci trattati con antibiotici hanno un tempo di transito alterato.

Una sfida comune vissuta in un ambiente naturale da parte di tutti gli organismi, in particolare il pesce, è lo stress osmotico. Gambusia hanno dimostrato di adattarsi rapidamente quando acutamente sottolineato in alte concentrazioni di salinità ^18. Sorprendentemente, pesce con un microbiome antibiotico-alterato esibito abbassato la sopravvivenza ad un elevato stress salino. Il meccanismo di questo romanzo fenotipo è sotto inchiesta. Un altro sforzo comune relativa agli animali acquatici, soprattutto in acquari, è forme tossiche di azoto (ammoniaca, nitrati, nitriti e). Survival contro nitrati non era significativamente differente tra trattata con antibiotici e controllo dei pesci. I metodi presentati in questo manoscritto possono essere utilizzati con Gambusia o simile modello pesci organismi, come zebrapesce e Medaka, per misurare fenotipi nel pesce seguenti manipolazione sperimentale.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in corso di approvazione dei protocolli IACUC, numerate 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, e 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, manipolazione, e cura etico Raccogliere Gambusia affinis dal sito campo (guida di identificazione a http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) utilizzando un piccolo tuffo rete e posto in 19 L secchi. Utilizzare ispezione visiva per identificare le specie. pesce Riposo per 1 – 2 d …

Representative Results

Un diagramma schematico generale del sistema sperimentale utilizzato per studiare gli effetti ospitanti pesci da esposizione ad antibiotici 13 è rappresentata nella Figura 1A e comprende la tecnica per estrarre la pelle (Figura 1B) e dell'intestino (Figura 1C) microbiomes dal pesce. Tre giorni è stato selezionato come il periodo di esposizione agli antibiotici, perché dati precedenti rivela che, mentre il n…

Discussion

Alcune sfide richiedono un periodo di riposo in PMU pulita dopo il trattamento antibiotico per il farmaco ad esaurirsi nei tessuti dei pesci. Se viene saltato il periodo di riposo poi presenza antibiotico può confondere i risultati, soprattutto quando il saggio comporta l'esposizione ai batteri. Al fine di esaminare gli effetti di una composizione microbiome alterato senza grandi variazioni nel numero totale di microbi sul padrone di casa, esperimenti preliminari monitoraggio della composizione microbiome (16S prof…

Materials

Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
PBS tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline