Undersøkelse av Host fenotyper i<em> Gambusia affinis</em> Etter antibiotikabehandling

Summary

Denne studien omfatter metoder for å avdekke effekter på en modell fisk rekke etter forandring av huden og tarmmiljøer mikrobiomer sammensetning av et antibiotikum.

Abstract

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduction

Det har blitt fastslått at antibiotika kan forstyrre den menneskelige mikrobiomer fører til dysbiosis, noe som betyr en mikrobiell fellesskap ubalanse. Den microbiota sin kompositoriske endring etter antibiotika behandlinger har vist seg å redusere samfunnets mangfold, redusere sentrale medlemmer, og endre samfunnet metabolisme, spesielt i tarmen ^{1, 2.} Antibiotikum forstyrrelse av tarmen mikrobiomer kan redusere kolonisering motstand mot Clostridium difficile ^{3, 4} og ⁵ Salmonella.

I tillegg har avbrudd av den bakterieflora vært knyttet til utvikling av mange syndromer og sykdommer hos mennesker (f.eks antibiotika-assosiert enterokolitt, inflammatorisk tarmsykdom, metabolske forstyrrelser, osv.). Antibiotika er også mye implementert i landbruket som vekst arrangører istorfe og fjørfe produksjon ^6. Bruken av disse kraftige verktøyene er ikke uten sikkerhet effekter, som er tydelig i den raske veksten av antibiotikaresistens, samt effekten av en forstyrret mikrobiomer har med sine bebodde vert. Mange studier har vist at bredspektret antibiotika-bruk har langvarige konsekvenser for strukturen og funksjonen av bakterieflora, men likevel bivirkninger fra en antibiotika-forstyrret mikrobiomer påvirker verts fysiologi er bare spekulasjoner som ennå ikke er støttet.

Samspillet mellom verts, bakterieflora, og antibiotika er langt fra å bli forstått i en kortfattet måte. Derfor er en enkel og mer medgjørlig modell fordel å belyse den meget komplekst pattedyr system. Slimhinneoverflater hos mennesker, inkludert tarmen, havnen den høyeste tettheten og mangfoldet av mikrober, og også de mest intime mikrobe-vert interaksjoner. Slimhinnene hud mikrobiomer av fiske tilbud several fordeler som et modellsystem. Den Teleostei (beinfisk) er en av de tidligste linjene til divergerer i Vertebrata betyr at teleoster har både medfødte og ervervede immunforsvar som har co-utviklet et forhold med commensal bakteriesamfunn ^7. Fiskeskinnet deler mange egenskaper med type 1 mukosale overflater av pattedyr, slik som fysiologiske funksjoner, immunkomponenter, og anordningen av mucus-produserende celler ^8. Den eksterne plassering av fiskeskinn mukosale overflaten gir en mikrobiomer lett å manipulere og eksperimentelt prøven.

Den vestlige mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), er en modell fisk som har blitt brukt tidligere for å studere parring og toksikologi ^{9, 10, 11.} Gitt den lille størrelsen, befolkningen overflod i naturen som en invaderende art, m inimal omsorg kostnader, og hardfør art, har vi utviklet G. affinis som en slimhinne mikrobiomer modell. Videre Gambusia dele fysiologi for å føde levende unger med vivipare pattedyr, som er uvanlig i fiskearter. Vi fullførte den mest omfattende studien på tidspunktet for fiskeskinn normal bakterieflora ved hjelp av 16S profilering med Gambusia ^12. Videre arbeid demonstrerte tre negative effekter på verten følgende avbrudd i huden og tarmen microbiota ved hjelp av en bredspektret antibiotikum ^13.

Fem forskjellige effekter ble undersøkt i fisken følgende antibiotika eksponering. Den mest veletablerte rekke fordel for mikrobiomer er konkurransedyktig utelukkelse av patogener. Fisken patogen Edwardsiella ictaluri er kjent for å forårsake utbrudd av enteriske septikemi i kommersielle steinbit gårder ^14. E. ictaluri har også vist seg å lethally infisere sebrafiskclass = "xref"> ^{15, 16} og Gambusia ^17. En utfordring med denne organismen fra vannsøylen kan tjene som et mål for eksklusjon. Som en sammenligning for å mottakelighet for en individuell patogen, ble overlevelse ved eksponering for en høy tetthet av blandede organismer også utført. Avføring og organisk-rik jord ble brukt som vanlig forkommende kilder til mikrobielle samfunn.

En annen etablert rolle bakteriell tarm samfunnet utfører er næringsstoff prosessering og energi høsting, og dermed påvirke den generelle næringsopptaket for verten. Som en grov måling av ernæring, ble fiskekroppsvekt sammenlignet før og etter en måned for å bli matet en standard diett. Antibiotika-behandlet fisk i gjennomsnitt gått ned i vekt mens kontrollfisken i gjennomsnitt gått opp i vekt i løpet av måneden. Mekanismen for denne manglende vektøkning er uklart. En mulig medvirkende faktor er transittiden av mat i tarmen. En GI motiheten Metoden ble tilpasset fra sebrafisk (Adam Rich, SUNY Brockport, personlig kommunikasjon) for å bestemme transitt tid. Det er ennå ikke bestemt om antibiotika-behandlet fisk har en endret transitt tid.

En felles utfordring opplevde i naturen av alle organismer, spesielt fisk, er osmotisk stress. Gambusia er blitt vist til raskt å tilpasse når akutt understreket i høye konsentrasjoner av salinitet ^18. Overraskende fisk med en antibiotika-forandres mikrobiomer oppviste redusert overlevelse til en høy salt stress. Mekanismen for denne romanen fenotype er under etterforskning. En annen vanlig belastning på akvatiske dyr, særlig i akvarier, er toksiske former av nitrogen (ammoniakk, nitrat og nitritt). Overlevelse mot nitrat var ikke signifikant forskjellig mellom antibiotika-behandlet og kontrollfisk. Metodene som presenteres i dette manuskriptet kan brukes med Gambusia eller lignende fisk modellorganismer, slik som sebrafisk og medaka, for å måle fenotyper i fisken etter eksperimentell manipulasjon.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført under godkjenning av IACUC protokoller, nummerert 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, og 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, håndtering, og livssyns Care Samle Gambusia affinis fra feltet området (identifikasjon guide på http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) med en liten dip net og sted til 19 L bøtter. Bruk visuell inspeksjon for å identifisere arter. Rest fisk for 1-2 d i en bøtte med vann i dammen. Etterpå overføre fisk…

Representative Results

En samlet skjematisk diagram av det eksperimentelle system som brukes til å studere fisk verts effekter av antibiotikum eksponering 13 er vist på figur 1A og omfatter teknikk for ekstraksjon av hud (figur 1B) og tarmer (figur 1C) microbiomes fra fisken. Tre dager ble valgt som antibiotika periode eksponering fordi tidligere data viser at mens det totale huden dyrkbare antall dråper tidlig i behandlingen, har de…

Discussion

Noen utfordringer krever en hvileperiode i ren APW etter antibiotikabehandling for at stoffet skal bli tømt i fiske vev. Hvis hvileperioden er utelatt, da antibiotika tilstedeværelse kan forvirre resultatene, særlig når analysen innebærer eksponering for bakterier. For å undersøke effekter av et endret mikrobiomer sammensetning uten store endringer i det totale antallet mikrober på verten, setting overvåking mikrobiomer sammensetning (16S profilering eller hele genomsekvensering) og befolkningstetthet (16S kvan…

Materials

Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
PBS tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline