주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

1970 년대 초반 이후 단층 널리 생물학적 시료 ^{1, 2, 3의} 구조적 특성에 사용 된 투과형 전자 현미경 (TEM)에 접근한다. 투과형 전자 단층의 매력이 전지의 구조 및 고분자 복합체 단백질의 구조 내 소기관의 미세 구조에서, 나노 스케일에서 생체 구조의 광범위한 연구하는 데 사용할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 투과형 전자 단층은 매우 두꺼운 샘플 (이상이 0.5㎛)을 연구하기 위해 이용 될 수 없었다. 실제로 두께 시험편 낮은 신호대 잡음비 (SNR)의 이미지를 생성하는 너무 많은 산란 전자를 생성한다. 또한, 단층의 경사각 증대 시료의 겉보기 두께, 기울어 진 시험편의 이미지의 컬렉션을 포함한다. 심지어 비탄성 산란을 필터링 할 수 있습니다하지만에너지 필터를 사용하여, 높은 SNR 이미지에 필요한 전자의 임계량 거의 TEM에 도달한다. 따라서, 생물학적 시료의 두께는 단지 ⁴ 절편하여 연구되어왔다.

들이 절단 될 때 약간 저하 될 수도 있고, 다른 복잡성을 이해하기 위해 그 전체 연구 할 필요 일부 샘플은 분리 될 수 없다. 다른 방법은 스캔 모드 ^{5, 6, 7, 8의} TEM을 사용하는 것이다. 투과 전자 현미경 (STEM)를 스캐닝, 전자의 광로가 종래의 TEM에서 다르다. 탄성 산란 그는 어두운 필드 (DF) 탐지기와 광축으로부터 소정의 각도에서 수집 될 수있는 반면 산란없이 샘플을 통과하는 전자는 밝은 필드 (BF) 검출기 ^(9)의 광축 상에 수집 될 수있다.STEM의 또 다른 장점은 집속 전자 빔 이미지의 픽셀 별 수집을 가능하게 시료의 표면에 주사되어있다. 시료 ^(10)를 통과하면서 전자빔이 넓어진 경우에도 특정 컬렉션 기법은 종래의 TEM 비탄 성적으로 산란 전자보다 덜 민감하다. 또한, TEM에 따라서 발생할 수있는 색수차 회피 STEM에는 렌즈 후의 시험편 없다. BF 검출기는 주로 unscattered 전자를 검출하도록 카메라 길이를 조정할 수있다. 두꺼운 샘플을 연구하기 위해 DF 검출기를 사용 때문에 부정확 한 이미지를 생성 다중 산란,하지 않는 것이 좋습니다. 대신, BF 검출기 ^(11)를 사용할 수있다. STEM 높은 SNR 이미지를 생성 할 수 있지만, 두께로부터 회수 될 수 깊이있는 정보의 양이 감소하기 때문에 TEM에 비하여 상대적으로 높은 광 수렴 비교적 낮은 심도를 갖고표본. 초점이 정보가 몇 나노 미터의 초점면에서 유래되도록 수렴 각도가 30 MRAD만큼 높을 수있는 수차 보정 STEM 현미경의 경우, 피사계 심도는 충분히 낮을 수있다 . 병렬 모드에 전자선을 설정하면 심도 전자빔의 해상도 ^(12)의 손해를 향상시킨다. 그러나,이 설정이 항상 가능한 것은 아니다.

이 수속 전자빔을 사용하는 것이 필요할 때마다, 하나의 두꺼운 샘플을 연구 할 때 심도 전자빔의 향상 기술을 사용한다. 최근 연구의 초점 정보 ^{(13), (14)의} 최대 양을 복구하는 시료에 걸쳐 다양한 초점 평면에서 다수의 이미지의 취득을보고 하였다. 두 연구에서 상이한 초점 평면의 정보를 처리하는 다양한 방법을 설명한다. Hovden 등은.다양한 초점 평면에서 수집 된 이미지는 푸리에 공간에서 결합하고 최종 재구성 ^{13 변형} 차원 역 푸리에로부터 직접 얻었다. 이에는 DAHMEN 외. 실 공간의 다양한 초점 평면 ^{(14)로부터의} 3 차원 볼륨을 재구성 수렴 빔 복원 엔진을 개발했다. 본 연구실은 두꺼운 생물학적 시료를 이미징하는 방법을 개발 하였다. 우리의 전략은 우리가 다양한 초점 평면에서 초점이 정보를 병합하고, 평행 광선 조사 장치 ^(15)를 이용하여 실 공간에서의 최종 3 차원 볼륨을 복원한다는 점에서 상기 한 두 방법과 다르다. 우리의 목표는 쉽게 전자 현미경 실험실에서 수행 될 수있는 방법을 개발 하였다. 이를 위해 종래의 단층 실험의 시간 프레임에 필적 ​​제한된 시간에 촛점 이미지를 수집 할 목적. 또한, 제안 된 방법 C정렬 및 재구성 소프트웨어의 종류와 사용하기 위해 적응 될 울드.

2015 ¹⁵ 우리 출판물의 맥락에서, 우리는 시각화와 피사계 심도의 회복을 특성화하고 싶었다, 그래서 우리는 25 MRAD의 큰 수렴 반 각도를 사용했다. 여기서는 2015 년 ¹⁵ 실험실에서 개발 된 방법에 따라 STEM에 관통 초점 촬상 행하는 단계별 프로토콜을 제공하고, 우리는 2015에서의 데이터 처리 방법을 제시 하였다. 이 방법은, 두께 (750 ㎚) 생물학적 샘플에 걸쳐 여러 초점 평면에서 초점 정보를 복구하고 고품질의 3D 재구성을 가능하게한다. 어디 관련, 다른 그룹에서 사용하는 방법에 비해이 방법의 차이도 제공됩니다.

Protocol

주의 : 사용하기 전에 각종 시약의 물질 안전 보건 자료 (MSDS에) 참조하십시오. 시료 전처리 과정에 사용되는 화학 물질의 일부 ​​및 / 또는 생식 독성, 발암 성 독성, 돌연변이이다. 샘플을 처리하는 동안 흄 후드 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발) 작업을 사용합니다. 을 Ultramicrotome 시료를 단면 예리한 도구의 사용을 포함하고, 이러한 도구주의 사용은 필수…

Representative Results

우리의 연구에서, 전자는 전계 방출 총 투과형 전자 현미경 200 kV의 가속되었다. 이미지는 20 μs의 지속 시간을 사용하여 줄기 BF 모드로 수집되었다. 관통 초점 틸트 시리즈의 디자인에 관해서는, 우리는 750 nm 두께의 생물학적 샘플도 전자빔의 피사계 심도가 있었지만 단지의 미세 구조 연구에 대한 만족스러운 결과를 준 내지 150 nm의 초점 간격을 발견 3 nm의 때문에 우리는…

Discussion

이 글에서, 우리는 관통 초점 단층 촬영 STEM을 사용하여 두께의 생물학적 시료에서 3D 분석을 수행하기위한 단계별 가이드와 함께 기존의 샘플 준비 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시료의 수지 매립은 수십 ^26에 사용되었으며, 시료의 종류에 맞게 다른 프로토콜은 문헌 ^(27)을 통해 찾을 수있다. 대조적으로, STEM에 영상 두꺼운 표본은 새로운 사업을 통해 초점 ?…

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS