Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

С начала 1970 - х годов, томографию подходы в просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) широко используется для структурной характеристики биологических образцов 1, 2, 3. Привлекательность просвечивающей электронной томографии в том, что он может быть использован для изучения широкого спектра биологических структур в нанометровом масштабе, от архитектуры клеток и ультраструктуры органелл к структуре макромолекулярных комплексов и белков. Тем не менее, просвечивающая электронная томография не может быть использован для изучения очень толстых образцов (более 0,5 мкм). Действительно, толстые образцы производят слишком много рассеянных электронов, создавая низкое отношение сигнал-шум (SNR) изображения. Кроме того, томография включает в себя сбор образов наклоненных образцов, с видимой толщиной образца с увеличением угла наклона. Несмотря на то, неупругое рассеяние может быть отфильтрованс использованием энергетических фильтров, критическое количество электронов, необходимых для высоких SNR изображений едва достигал в ПЭМ. Следовательно, толстые биологические образцы только были изучены с помощью секционирования 4.

Некоторые образцы не могут быть нарезаны: некоторые из них могут ухудшиться, если они отрезаны, а другие должны быть изучены во всей их полноте, чтобы понять их сложность. Альтернативный подход заключается в использовании ПЭМ в режиме 5, 6, 7, 8 сканирования. В сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM), оптический путь электронов отличается от таковой в обычных ТЭМ. Электроны , проходя через образец без рассеяния могут быть собраны на оптической оси с детектором 9 светлого поля (BF), в то время как те упругое рассеяние может быть собрана под определенным углом от оптической оси с детектором темного поля (DF).Другим преимуществом является то, что STEM сфокусированный электронный пучок сканируется на поверхности образца, что позволяет коллекции элемент за пикселем изображения. Даже при том , что электронный луч расширяется при прохождении через образец 10, эта конкретная схема сбора менее чувствительна к неупругорассеянных электронов по сравнению с обычными ТЭМ. Кроме того, нет линзы после образца в STEM, что позволяет избежать хроматических аберраций, которые могут возникнуть в ПЭМ. Длина камеры может быть отрегулирован таким образом, чтобы детектор БФ главным образом обнаруживает нерассеянный электроны. Использование детектора DF для изучения толстых образцов не рекомендуется из-за многократного рассеяния, которое производит неточные изображения. Вместо того, чтобы детектор BF может быть использован 11. В то время как STEM может произвести высокое SNR изображения, он имеет относительно низкую глубину резкости из-за относительно высокой сходимости пучка по сравнению с ТЕМ, уменьшением количества информации, содержащейся в углубленных, которая может быть извлечена из толстойобразцы. В случае аберраций скорректированной STEM микроскопах, где угол сходимости может достигать до 30 мрад, поле глубины может быть достаточно низкой, чтобы информация, которая находится в фокусе берет свое начало от фокальной плоскости лишь несколько нанометров , Настройка электронного пучка в параллельном режиме увеличивает глубину резкости электронного пучка в ущерб резолюции 12. Тем не менее, эта установка не всегда возможно.

Всякий раз, когда необходимо использовать сходящийся электронный пучок, необходимо использовать методы, которые увеличивают глубину резкости электронного пучка при изучении толстых образцов. Недавние исследования сообщили о приобретении нескольких изображений в различных фокальных плоскостях по всему образцу для восстановления максимального количества в фокусе информации 13, 14. Два исследования описывают различные способы обработки информации из различных фокальных плоскостях. Hovden и др.объединены в фурье - пространстве образы , которые были собраны в различных фокальных плоскостях, а окончательная реконструкция была получена непосредственно из 3D - обратное преобразование Фурье 13. В противоположность этому , Dahmen и др. разработал сходящийся двигатель реконструкции пучка для реконструкции в реальном пространстве 3D - объем от различных координационных плоскостей 14. Наша лаборатория также разработала метод визуализации толстых биологических образцов. Наша стратегия отличается от двух методов , описанных выше , в том , что мы объединили информацию , которая находится в фокусе в различных фокальных плоскостях и реконструировано конечный объем 3D в реальном пространстве с помощью параллельного луча проектора 15. Наша цель состояла в том, чтобы разработать метод, который может быть легко осуществлен в любой электронной микроскопии лаборатории. С этой целью мы стремились собрать фокусные изображения в ограниченном количестве времени, сопоставимого со сроками обычных экспериментов томографии. Кроме того, предложенный нами метод сульд быть адаптирован для использования с различными типами выравнивания и программного обеспечения восстановления.

В контексте нашей публикации с 2015 15, мы хотели , чтобы визуализировать и охарактеризовать восстановление глубины резкости, таким образом , мы использовали большой сходимости полу-угол 25 мрад. Здесь мы приводим протокол шаг за шагом для выполнения сквозного фокусного изображения в STEM в соответствии с методикой , разработанной в нашей лаборатории в 2015 году 15, и мы представляем , как были обработаны данные с 2015 года. Этот метод восстанавливает в фокусе информацию от нескольких координационных плоскостей по всей толстой (750 нм) биологического образца и обеспечивает высокое качество 3D-реконструкций. Там, где это уместно, различия в этой методологии по сравнению с методами, используемыми другими группами, также представлены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Внимание: Обратитесь к Паспорта безопасности (MSDS) различных реагентов перед их использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в процессе приготовления образца являются токсичными, канцерогенными, мутагенными, и / или репротоксичных. Используйте средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, полнометражные брюки и закрытую обувь) и работать под вытяжкой при обработке образца. Секционирование образца с ультрамикротоме предполагает использование острых инструментов, и осторожное использование этих инструментов является обязательным. В шагах, описанных ниже, авторы предполагают, что образец представляет собой образец культуры клеток. Протокол может потребоваться изменить в соответствии с типом образца, особенно стадиях центрифугирования.

1. Приготовление буферами и смесей

  1. Готовят раствор с фосфатным буфером (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 10 мМ Na 2 HPO 4, и 1,76 мМ КН 2 РО 4).
  2. Готовят растворы, содержащие 30%, 50% и 70% егhanol в PBS для образца обезвоживания. Выполните образец обезвоживания путем постепенного инкубирование образца в возрастающих концентрациях этанола.
  3. Подготовка эпоксидной смолы путем смешивания бисфенол-A- (эпихлоргидрин) (20 мл), додеценил янтарного ангидрида (9 мл), метил-5-норборнен-2,3-дикарбоновой кислоты (11 мл), и 2,4,6-трис ( диметиламинометил) фенол (0,7 мл); другие пропорции смешивания могут быть использованы в зависимости от желаемой жесткости смолы.
  4. Готовят растворы, содержащие 30%, 50% и 70% эпоксидной смолы в этаноле для образца вложении. Выполнение смолы вложение путем постепенного инкубирование образца с увеличением концентрации смолы.
    Примечание: Объемы приготовленных растворов зависит от типа образца, который изучается. Другие растворы необходимы для тканей, чем для клеточных культур.

2. Закрепление и Окрашивание пробы

  1. Центрифуга клеточной культуры в течение 5 мин при 5000 х г. Выполните все следующие центрифугировани с использованием тех же условий.
  2. Жидкость над осадком сливают и фиксируют клеточный осадок путем ресуспендирования его в PBS (1 мл) с 4% параформальдегида и 2% глутаральдегида. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин (Рис . 1А) В качестве альтернативы, зафиксировать клетки, при 4 ° С в течение ночи или в течение уик-энда.
  3. После центрифугирования, удалить супернатант и мыть Таблетку 3 раза PBS (1 мл), чтобы полностью удалить закрепляющие агенты.
  4. После фиксации образца с 1% OSO 4 в PBS (1 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. После центрифугирования, удалить супернатант и мыть Таблетку 3 раза PBS (1 мл) , чтобы полностью удалить ИКС 4. Деактивировать ИКС 4 в масле и выбросьте.
  6. Добавить 2% ацетата уранила в PBS (1 мл) в качестве контрастного агента и инкубировать образца в течение 30 мин при комнатной температуре (Фиг.1В).
  7. После центрифугирования, удалить супернатант и мыть Таблетку 3 раза PBS (1 мл), чтобы удалить несвязанный уранил ACацетатом; уранилацетате содержит радиоактивные элементы и должны быть утилизированы в бункере, посвященном радиоактивных отходов.
    Примечание: инкубационного могут быть изменены в зависимости от размера образца. Например, фиксации и окрашивания более толстых образцов, таких как тканей образцов, требуют более длительного времени инкубации. Более длительное время инкубации также может быть лучше для обезвоживания и шагов вложения. Уранилацетате может быть заменен на "уранил-менее" раствором, который содержит соли гадолиния.

3. Образец Обезвоживание

  1. После центрифугирования, отбросить супернатант и инкубировать образца в течение 30 мин при 4 ° С в PBS (1 мл) с 30% -ным этанолом (рис 1C).
  2. Повторите шаг 3.1 с использованием растворов с постепенному повышению концентрации этанола (50%, 70%, и до 100%). В ходе этих этапов дегидратации, поддержание образца при температуре 4 ° С в целях сохранения образца.
  3. После центрифугирования, отбросить supernatмуравей и ресуспендируют осадок в чистом этаноле (1 мл); инкубировать в течение ночи при температуре 4 ° С.

4. Смола Вложение

  1. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в этаноле с 30% эпоксидной смолы (1 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре (рис 1D).
  2. Повторите шаг 4.1 с использованием растворов с концентрацией постепенно увеличивая эпоксидной смолы (50%, 70%, и до 100%).
  3. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в чистом эпоксидной смолы (1 мл); Выдержите в течение ночи при комнатной температуре. Наличие закалка DMP-30 может вызвать полимеризацию смолы; если это произойдет, приготовить две порции эпоксидной смолы, один с и один без DMP-30.
  4. После центрифугирования, ресуспендируют осадок в 200 мкл чистой эпоксидной смолы (содержащей отвердитель) в пластиковой капсуле; образец должен быть в нижней части пластиковой капсулы.

5. Смола Полимеризация

  1. яncubate пластмассовую капсулу, содержащую образец в инкубатор при 60 ° С в течение 48 ч; другие виды смолы может полимеризоваться с различными настройками.
  2. Удалить капсулу из инкубатора и убедитесь, что смола полимеризуется; смола должна быть жесткой, если нажать на твердую поверхность.
  3. Добавить чистой эпоксидной смолы (содержащие отвердитель) в верхней части полимеризованной смолы, содержащей образец; Этот дополнительный слой смолы будет легче вырезать образец. Выдержите в капсулу при 60 ° С в течение 48 ч.

6. Пример секционирования

  1. Установить образец вверх-вниз в держателе образца таким образом, чтобы образец в направлении сверху и зафиксировать его на отсекатель блоке ультрамикротоме. Плотно зафиксировать рычаг, чтобы закрепить блок подрезки к ультрамикротоме.
  2. С помощью лезвия бритвы или аналогичный острый режущий инструмент, вырезать пластиковую капсулу, чтобы отделить его от полимеризованной смолы. Обрежьте смолы таким образом, чтобы образец содержитред в смоле примерно в форме пирамиды. Там нет необходимости, чтобы удалить всю пластиковую капсулу; удалить только часть, закрывающую полимеризованный образца.
  3. Возьмите капсулу и держатель образца прочь отсекатель блока и установить их на подвижном плече ультрамикротоме.
  4. Установить подрезки нож на блоке ножа и аккуратно подрезать грани пирамиды. Использование биноклей рекомендуется дать идеальную форму для пирамиды; тем лучше пирамида, тем лучше разделы будут.
  5. Взлет обреза нож и заменить его гистологии ножом, который может быть использован, чтобы сократить разделы, которые толще, чем 0,5 мкм.
  6. После заполнения кювету гистологии ножа с правильным количеством воды, довести режущую кромку ножа к поверхности образца и использовать бинокль для регулировки угла тангажа капсулы таким образом, что нож будет резать перпендикулярно по отношению к пирамиде.
  7. Регулировка скорости резания в соответствии с желаемойтолщина секции для восстановления однородных секций.
  8. Пусть раздел поплавок над водой и ловить ее с петлей.
  9. Перемещение петли в направлении к медной сетке электронной микроскопии, который был помещен на верхней части фильтровальной бумаги.
    Примечание: Сетка должна была обработана ранее, чтобы увеличить его гидрофильность. Это может быть выполнено с ручкой сетчатую покрытием.
  10. Из-за поглощения воды с помощью фильтровальной бумаги, пусть секция прилипает к сетке. Дайте высохнуть в течение нескольких минут, прежде чем вставить его в электронный микроскоп.

7. Конструкция Tilt-серии Through фокусным расстоянием

  1. Соберите сквозные координационные изображения через постоянные интервалы времени фокусировки.
    Примечание: Сквозное фокусного поворотно-серии состоят из множества сквозных фокальных изображений, которые собираются на каждом углу наклона наклонной серии. Амплитуда фокус целом должно быть достаточно, чтобы покрыть всю толщину образца.
  2. Определить величину интервала фокусировки. Если интервал равен Depth резкости, собрать весь образец в фокусе; эта установка представляет собой наивысшую возможную выборку. Если интервал больше, чем глубина резкости, некоторые части образца не будут приобретены в фокусе, а это означает, что некоторые части образца не будут собраны в фокусе.
  3. Вычислить глубину резкости электронного пучка с длиной волны электрона и сходимость полуприцепа угла пучка электронов. В то время как длина волны электронов непосредственно связана с ускоряющим напряжением, используйте схождения полу-угол , предоставляемая производителем электронного микроскопа или определить его экспериментально из дифракционной картины известного образца 16. Поскольку электроны ускоряются при длине волны попадают на образец с схождения полуприцепа углом & alpha; в электронном микроскопе, используйте следующее уравнение для определения глубины резкости (DOF):

    Уравнение
  4. дизайнфокусное серии , так что амплитуда фокус весь будет охватывать образца при его максимальной толщины видимой (то есть, на самом высоком наклоне).
    ПРИМЕЧАНИЕ мкм толщиной образца 0,75 будет иметь видимую мощность 2,19 мкм при наклоне 70 °, так что амплитуда внимание должно быть больше, чем 2,19 мкм. Для этого образца, если интервал фокусировки определяется выше, равна 50 нм, это потребует 44 изображений (2,19 мкм / 50 нм) для покрытия образца при его максимальной видимой толщины. Амплитуда фокус Целое равно значению интервала фокусировки, умноженной на число координационных шагов. На самом высоком наклоне (q), образец очевидной толщины определяется следующим образом:

    Уравнение

8. Образец обработки изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Это выходит за рамки этого протокола, чтобы описать, как настроить электронный микроскоп в режиме STEM; большая часть этой информации можно найти яп справочное руководство, предоставляемая производителем электронного микроскопа. Однако следует иметь в виду следующее: I) размер пятна должен быть выбран в соответствии с желаемым увеличением; II) Ronchigram должны быть хорошо выровнены; и III) в режиме BF, длина камеры должна быть скорректирована, чтобы выбрать нерассеянный электроны, сохраняя при этом хорошую освещенность детектора. Разделы смолы, осажденные на электронной микроскопии медные сетки должны быть освещены до приобретения изображения для предотвращения усадки. Смола усадки и эффекты зарядки могут быть посрамлены во время получения изображения. Использование объективной диафрагмы объектива может улучшить стабильность образца при возникновении зарядки эффектов. Тем не менее, в конкретном случае стеблевой установок, апертуре объектива не совместим с режимом HAADF формирования изображения, и очень небольшие объективные проемы не совместимы с режимом Б.Ф. визуализации.

  1. Используя низкое увеличение (около 20,000X в STEM), просматривать через образец и найти интересующую область.
  2. Отрегулировать тон eucentric высоту (Z-ось) так, что область интереса не отпасть при вращении образца.
  3. Убедитесь в том, что объектом интереса будет оставаться видимым во всем диапазоне наклона.
  4. Из-за значительного количества изображений, полученных во время наклона серии по-очаговый, использовать программы автоматического сбора. Либо использовать коммерческое решение или разработать программное обеспечение для сбора данных на заказ, если это необходимо. Убедитесь, что программа программного обеспечения способен выполнить три следующие действия:
    1. Отслеживание и фокус, как в стандартной схеме сбора наклона серии.
    2. Обеспечение того, что сквозные фокусного изображения перекрываются с Z-положения образца.
    3. Автоматически получить ряд сквозных фокусных изображений на каждом углу наклона.
  5. Дайте программе программного обеспечения основные параметры сквозного фокусного наклона серии (то есть, очаговые интервалы, фокусное шаг, минимальный угол наклона, максимальный угол наклона, шаг наклона и скорость сканирования).
  6. Началопроцесс сбора изображений и ждать, пока программа программное обеспечение, чтобы закончить.

Обработка 9. Изображение

Примечание: В этом протоколе, обработка через очаговых наклона серии выполняется с использованием ImageJ плагинов 17. Дополнительные данные 1 показывает ImageJ макрос для шага выравнивания (Turboreg) и для объединения в фокусе информации (Увеличение глубины резкости) для наклона серии сквозного фокусного разработан с тремя значениями фокусировки.

  1. Выравнивать изображения , собранные под тем же углом наклона (т.е. сквозные фокальные изображения). Так как изображения не имеют ту же информацию в фокусе, они не питают те же возможности для выравнивания; выполнить выравнивание путем выравнивания соседних изображений по двое (то есть, следуя иерархии пирамидальные, с ближайшими значениями фокус) с использованием первых Turboreg 18, в ImageJ плагин.
  2. Последовательно проверьте выравнивание с помощью очаговых изображений на каждом углу наклона.Стек выровненные сквозные координационные изображения, чтобы улучшить визуальный осмотр.
    Примечание: Только зона, которая находится в фокусе должна двигаться во время просмотра через стек. Точное выравнивание является наиболее важным, так как следующий шаг заключается в восстановлении информации, которая находится в фокусе от различных изображений.
  3. Объединить информацию , которая находится в фокусе использования расширенной глубины резкости 19, плагин ImageJ; это, в конечном счете сформировать единое изображение из стопки изображений. Некоторые настройки могут быть использованы в процессе восстановления глубины резкости, но и использовать самые высокие настройки, чтобы сохранить информацию об изображении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: поворотно-серия теперь состоит из одного изображения на угол наклона, каждое изображение, содержащее информацию в фокусе оправилась от сквозного фокусных изображений.
  4. Процесс данных.
    Примечание: Стандартные инструменты для выравнивания и реконструкции могут быть использованы, так как данные в настоящее время сводится к стандартной наклона серии. В этом протоколе, TomoJ это мые изд для выравнивания данных и восстановления данных 20, 21. Более подробно о том , как использовать TomoJ можно найти в оригинальной публикации 22.
  5. Выполните тонкую выравнивание наклона серии.
    Примечание: Хорошая стратегия состоит в том, чтобы использовать золотые шарики в качестве реперных маркеров, чтобы точно отслеживать изменения между изображениями. Локальные минимумы также могут быть использованы, если золотые шарики не могут быть добавлены к образцу.
  6. Выполнение 3D-реконструкция выровненной данных; несколько алгоритмов доступны для выполнения реконструкций в реальном пространстве или в пространстве Фурье, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения.
  7. Если окончательное выравнивание наклона серии оставляет желать лучшего, сделать некоторые улучшения за счет оптимизации начальных шагов. Подтверждают шаги выравнивания, если конечный 3D реконструкции выглядит размытым или деформируется; на практике, тем больше количество собранных фокальных плоскостях, тем выше контрастность и детали реконструкции 3D.
    Примечание: SeVeral программы программного обеспечения могут быть использованы для обработки сквозного фокусного наклона-й серии. Тем не менее, были выбраны инструменты, используемые в настоящем протоколе, так как, по нашему опыту, они показали наилучшие результаты. Turboreg 18 выполняется лучше с точки зрения выравнивания изображений , когда градиент фокуса присутствовал. Более подробную информацию можно найти на специализированном веб - сайте 23. Увеличение глубины резкости плагин 19 выполнена очень хорошо с точки зрения извлечения информации в фокусе из различных изображений, в то время как другие инструменты привели видимых пикселей модификаций. Более подробная информация, особенно в отношении написания сценария, можно найти на этом специальном веб - сайте 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В нашем исследовании, электроны ускоряются до 200 кВ в автоэмиссии передачи пушки электронного микроскопа. Изображения были собраны в режиме STEM BF с использованием 20-мкс времени задержки. Что касается конструкции сквозного фокусного наклона серии, мы обнаружили, что фокус интервалы 150 нм дали удовлетворительные результаты для ультраструктурным исследования 750 нм толщиной биологический образец, даже несмотря на то глубины поля электронного пучка только 3 нм, так как мы использовали очень большой конвергенции полу-угол 25 мрад.

Образец анализируется в данном отчете , является Trypanosoma brucei, одноклеточный эукариот которого жгутик интенсивно изучается , поскольку это органеллы заметно законсервирован от протистов до млекопитающих 25. Клетки обрабатывали , как представлено в протоколе подготовки образца, и мы сосредоточили структурный анализ на флагеллярной кармана Т. brucei ( (рис 2B, C и D). На собранные образы, зона, которая находится в фокусе появляется тонкая, и большая часть изображения размыты из-за ограниченного поля глубины. Сращивание информации в фокусе выполняется на собранных изображений и создает одно изображение, где зона фокусировки значительно шире (рис 2E).

Объединение информации в фокусе может быть лучше визуализировать, выделив высокочастотные области изображений через очаговых наклона серии (белые пиксели на рисунке 2F, G и H). Команда ImageJ "Find Edges" был намред в настоящем исследовании. Эта команда использует Собел фильтр для обнаружения изменений в соседних интенсивностей пикселей. Смещение обнаруженной области высоких частот можно наблюдать с одного изображения к другому. На изображении , где была слита информация в фокусе, высокие частоты охватывают большую часть образа (рис 2i). Этот метод позволяет проверку хорошей обработки сквозного фокальной наклона серии.

Использование сквозной фокусного наклона-й серии, дополнительная информация в фокусе собирается и используется в процессе 3D-реконструкции. Это дает больший контраст и SNR и уменьшает размытость эффекты , наблюдаемые в 3D - реконструкций глубины резкости изображений, ограничено 15. В фурье - пространстве, дополнительная информация извлекается по сравнению с классической схемой сбора наклона серии, где только на фокальной плоскости собирается 13. В целом, качество на протяжении всего 3реконструкция D является более изотропным по сравнению с классической схемой сбора наклона серии.

Рисунок 1
Рисунок 1: Изображения , представляющие различные этапы биологического протокола подготовки образца. Протокол подготовки образца можно разделить на четыре этапа питающей сети. Образец А) зафиксирован в параформальдегидом и глутаровый альдегид, В) фиксировали в осмия и контрастируют с уранил - ацетатом, C) обезвоженной в этаноле, и D) , внедренный в смоле. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Проверка восстановления глубины резкости. Восстановление поля глубины может быть проверена на изображениях наклонном образца. A) При 0 ° наклона, некоторые детали можно наблюдать в флагеллярной карман (карман) Флаг смолы встраиваемый Т. brucei клетки. Флагеллярный карман находится в цитоплазме (цитохрома) и базальные тела (ВВ) анкеры жгутик (Flag) к флагеллярной мембране. В, С, и D) Три изображения одного и того же флагеллярной кармана, наклоненной на 70 ° в электронном микроскопе, были приобретены. Они были собраны с фокусных интервалами 300 нм. E) Это изображение было сгенерировано Увеличение глубины резкости ImageJ плагин и содержит информацию в фокусе В, С и D. F, G, H и I) Эти изображения были вычислены с помощью команды "Find Edges" в ImageJ для того, чтобы HIGHLIGHT информация высокочастотная, содержащаяся в B, C, D, и Е соответственно. Белые пиксели представляют собой высокие частоты, соответствующей информации в фокусе. Шкалы составляет 250 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Справочная 1. Файл Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы представляем традиционный протокол подготовки образца вместе с руководством шаг за шагом для выполнения 3D-анализа на толстых биологических образцов с использованием STEM через очаговых томографии. Смола вложение биологических образцов был использован в течение десятилетий 26, и альтернативные протоколы, адаптированные к различным видам образцов можно найти в литературе 27. В отличие от изображений толстых образцов в STEM с использованием расфокусированной методов является новое начинание, и методы, скорее всего, будет улучшена, как она становится все более широкое распространение.

Целью данной работы было описать протокол подготовки проб и, более конкретно, условия формирования изображений для выполнения сквозных фокусного приобретения наклона серии стволовыми с оборудованием, которое в настоящее время доступен и в разумные сроки. По этой причине были использованы большие интервалы фокусировки. В самом деле, не существует единого мнения о том, насколько близкокоординационные плоскости должны быть для получения изображения толстого образца с хвостовиком для сквозного фокусного наклона серии. Обычно это занимает до нескольких секунд, чтобы собрать STEM изображения, и весь обычный поворотно-серии может занять несколько часов, чтобы закончить. В качестве доказательства правильности концепции, можно собрать сотни или даже тысячи изображений. Тем не менее, очевидно, что длительное время сбора не подходят для повседневного использования. Устойчивость пучка и дрейфа образца должны быть приняты во внимание при проектировании таких долгих экспериментов. Кроме того, длительное время сбора поднимают вопрос о накопленной дозы электронов. Таким образом, на некоторое время, STEM через очаговых наклона серии подходит только для изучения лучевых устойчивых образцов, таких как смолы встраиваемый биологических образцов или неорганических материалов, в основном из-за существенной дозы электронов требуется. Из-за компромисс между временем приобретения и качества конечного 3D-реконструкции, мы рекомендуем использовать несколько через очаговых интервалы в проектах, где не требуется высокое разрешение, Aго мы рекомендуем использовать большее количество сквозных фокусных интервалов в проектах, где требуется высокое разрешение.

Существует отсутствие консенсуса в отношении конкретных шагов в этом способе из-за своей новизны. Тем не менее, очевидно, что некоторые шаги имеют решающее значение для высококачественных реконструкций из STEM через очаговых наборы данных наклона серии. Во- первых, выравнивание фокальных изображений на каждом углу наклона должен быть тщательно выполнена, как указано в трех оригинальных статей , описывающих через очаговых коллекции изображений 13, 14, 15. Даже если изображения, собранные при различных фокусных значений не разделяют общую информацию, Turboreg остается хорошим решением для точного, автоматического выравнивания изображений. Во-вторых, объединение фокальных изображений, как выполнено в данном протоколе, имеет преимущество генерации одного изображения каждого угла наклона, который легко обрабатывается любым наклоном серии Alignния и 3D программа реконструкции. Увеличение глубины резкости плагин был первоначально разработан для световой микроскопии изображений; тем не менее, как представляется, наилучшим решением для объединения информации в фокусе с помощью электронного микроскопа 28. Альтернативным решением является рассмотреть весь набор изображений в виде одной поворотно-серии набора данных с несколькими изображениями на угол наклона, подобно тому , что было сделано Hovden и др. 13 и Dahmen и др. 14. Это требует использования алгоритмов Фурье на основе реконструкции 13 или Ettention, который был разработан Dahmen и др. 29 и который является единственным 3D программного обеспечения восстановления , которые могут реконструировать 3D - объемы из изображений , собранных при различных фокусных значений в реальном пространстве. Примечательно, что такие альтернативные решения потребует дополнительного шага выравнивания в фокальной направлении (Z-оси), которая может производить путаницу RESULTS, которые несовместимы с интервалами дефокусировки выбранных во время сбора изображений, как описано в Dahmen и соавт. 14. Сращивание информации в фокусе, как это представлено в данном протоколе, имеет преимущество формирования изображения, как если бы были собраны данные с использованием параллельного, что позволяет избежать этого дополнительного шага выравнивания в Z-направлении.

Через очаговых методы наклона серии были разработаны для изучения толстых образцов (около 1 мкм). Основным ограничением этих методов состоит в том, что они не могут быть использованы для изучения образцов большей толщины, чем несколько микрон, так как электронный луч не может проникать такие образцы. Это ограничение происходит от длины свободного пробега электронов, которая зависит от ускоряющего напряжения. Несмотря на то, очень высокого напряжения (то есть, 1000 кВ) электронные микроскопы могут быть использованы для получения изображения эукариотических клеток 30, очень толстые образцы все еще требуют использования других методов, таких как Focused ионного пучка или последовательный блок-лицо сканирующей электронной микроскопии 31, 32. Однако эти методы порождают анизотропные реконструкций, которые можно считать стопок изображений, так как Z-оси, которая определяется как глубина резания метода, не эквивалентно Х- и Y-осей. Эти методы не могут быть использованы для исследований с высокой разрешающей способностью.

В 2014 и 2015 годах, три оригинальные статьи сообщали различные методы для работы с изображениями толстых образцов 13, 14, 15. С тех пор лишь немногие исследования использовали любой из этих методов для изучения образцов толщиной 33. Улучшения в методах поможет обобщить сквозные фокусного изображений в STEM. В частности, в области наук о жизни, через очаговых методы должны быть оптимизированы для наблюдения образцов в криогенных условиях. Это является серьезной проблемой, так как криогенные образцыособенно чувствительны к электрону дозы, и через фокус-методы требуют много изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).

Tags

Клеточная биология выпуск 121 электронная томография сканирование просвечивающей электронной микроскопии толстый биологический образец, Глубина резкости через очаговых поворотно-серии
Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trépout, S., Bastin, P., Marco, … More

Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter