This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.
This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.
1970'lerin başından beri, tomografi yaygın biyolojik örneklerin 1, 2, 3 yapısal karakterizasyonu için kullanılmıştır transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yaklaşımları. Transmisyon elektron tomografi Temyizinizi hücre mimarisi ve makromoleküler kompleksler ve proteinlerin yapı organellerin ultrastrüktürü arasında, nanometre ölçeğinde biyolojik yapıların geniş bir çalışma için kullanılabilir olmasıdır. Bununla birlikte, elektron tomografisi çok kalın örnekleri (daha büyük 0,5 um) incelemek için kullanılabilir olabilir. Nitekim, kalın örnekleri düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) görüntüler oluşturmak, çok dağınık elektronlar üretir. Buna ek olarak, tomografi eğim açısı ile artan numunenin belirgin kalınlıkta, eğimli örneklerin görüntüleri koleksiyonu içerir. Hatta inelastik saçılma filtre edilebilir olsa daEnerji filtreleri kullanarak, yüksek SNR görüntüler için gerekli elektron kritik miktarı ancak TEM ulaşılır. Bu nedenle, kalın biyolojik örnekler sadece 4 kesit kullanılarak incelenmiştir.
onlar kesilir bazı düşürebilir, ve diğerleri kendi karmaşıklığını anlamak için kendi bütünlüğü içinde çalışılması gereken: Bazı numuneler dilimlenmiş edilemez. Alternatif bir yaklaşım, tarama modu 5, 6, 7, 8 TEM kullanmaktır. transmisyon elektron mikroskobu (STEM) tarayarak olarak, elektronların optik yol, geleneksel TEM farklıdır. Elastik dağılmış olan koyu alan (DF) detektörü ile optik eksenden belirli bir açı ile toplanabilir ise saçılma olmadan örnek geçen elektronlar, parlak-alan (BF) detektörü 9 optik eksen üzerinde toplanabilir.KÖK diğer avantajı odaklanmış bir elektron ışını görüntüleri piksel-piksel toplama sağlayan numunenin yüzeyi taranır olmasıdır. Numune 10 geçerken elektron ışını genişletir olsa da, bu özel koleksiyon düzeni geleneksel TEM daha esnek olmayan dağınık elektron daha az duyarlıdır. Ayrıca, bu suretle TEM oluşabilir kromatik sapmaları kaçınarak STEM hiçbir objektif sonrası numune vardır. BF detektörü esas unscattered elektronlar algılaması için Kamera boyu ayarlanabilir. Kalın örnekleri incelemek için DF dedektörü kullanılarak, çünkü yanlış görüntüler üretir çoklu saçılma, tavsiye edilmez. Bunun yerine, BF detektörü 11 kullanılabilir. KÖK yüksek SNR görüntüler üretmek mümkün olmakla birlikte, kalın elde edilebilir derinlemesine bilgi miktarını azaltarak, çünkü TEM kıyasla nispeten yüksek ışın yakınsama nispeten düşük derinliği-of-field vardırnumuneler. odakta bilgi sadece birkaç nanometre bir odak düzlemi kaynaklanan şekilde yakınsama açısı 30 Mrad kadar yüksek olabilir sapmaları düzeltilmiş KÖK mikroskobu, durumunda, derinliği alanı kadar düşük olabilir . Paralel mod elektron ışını ayarlama derinliğini alan elektron ışınının çözünürlüğü 12 zararına artırır. Bununla birlikte, bu kurulum her zaman mümkün değildir.
Bir yakınsak elektron demeti kullanımı için gerekli olan zaman, tek bir kalın örnekleri incelenirken derinliğini alan elektron ışını arttırmak teknikleri kullanmak gerekir. Son çalışmalar içinde odak bilgileri 13, 14 maksimum miktarda kurtarmak için numune boyunca çeşitli odak düzlemleri birden fazla görüntü alımını bildirdi. İki çalışmalar, farklı odak düzlemleri bilgi işlemek için farklı yolları açıklanmaktadır. Hovden ve diğ.Çeşitli odak düzlemleri toplanmıştır görüntüleri Fourier uzayında birleştirildi ve nihai imar 13 dönüşümü 3D ters Fourier doğrudan elde edilmiştir. Bunun aksine, Dahmen ve ark. Gerçek uzayda çeşitli odak düzlemleri 14 3D hacmini yeniden bir yakınsak ışın yeniden motorunu geliştirdi. Laboratuvarımız ayrıca kalın biyolojik örneklerin görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Bizim stratejimiz, biz çeşitli odak düzlemleri içinde odak olan bilgileri birleşti ve bir paralel ışın projektörü 15 kullanarak gerçek uzayda son 3D hacmini yeniden ki yukarıda anlatılan iki yöntemden farklı oldu. Amacımız, kolaylıkla bir elektron mikroskobu laboratuarda yapılabilir bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, geleneksel tomografi deneylerin zaman çerçevesi ile karşılaştırılabilir zaman sınırlı bir miktarda, odak görüntüleri toplamak amaçlanmıştır. Ayrıca, önerilen yöntem chizalama ve yeniden yazılım farklı tipleri ile kullanılmak üzere uyarlanabilir ould.
2015 15 bizim yayın bağlamda, görselleştirmek ve derinliği alanının kurtarma karakterize etmek istedim, bu yüzden biz 25 mrad büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. Burada, 2015 yılında 15 laboratuvarda geliştirilen yönteme göre STEM yoluyla odak görüntüleme gerçekleştirmek için bir adım-adım protokolü mevcut ve biz 2015 verileri işlendi nasıl sunuyoruz. Bu yöntem kalın (750 nm) biyolojik numune boyunca birçok odak düzlemleri gelen odak bilgileri kurtarır ve yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon sağlar. Uygun durumlarda, diğer gruplar tarafından kullanılan yöntemlerden karşı bu metodoloji farklılıklar da sunulmuştur.
Bu makalede, biz aracılığıyla odak tomografi STEM kullanarak kalın biyolojik örnekler üzerinde 3D analizlerini gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuz ile birlikte geleneksel numune hazırlama protokol mevcut. Biyolojik örneklerin reçine gömme yıllardır 26 için kullanılır olmuştur, ve örneklerin farklı uyarlanmış alternatif protokoller literatürde 27 boyunca bulunabilir. Bunun aksine, STEM görüntüleme kalınlıkta numuneler yeni bir teşebb…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
Epoxy resin | EMS | 14120 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |