Introduction
Siden begyndelsen af 1970'erne, tomografi tilgange i transmissionselektronmikroskopi (TEM) er ofte blevet brugt til strukturel karakterisering af biologiske prøver 1, 2, 3. Appellen af transmissionselektronmikroskopi tomografi var, at det kunne bruges til at studere en bred vifte af biologiske strukturer på nanometer skala, fra arkitektur af celler og ultrastruktur organeller til strukturen af makromolekylære komplekser og proteiner. Ikke desto mindre kunne transmissionselektronmikroskopi tomografi ikke anvendes til at studere meget tykke prøver (større end 0,5 um). Faktisk tykke prøver producerer for mange spredte elektroner, genererer lavt signal-til-støj forhold (SNR) billeder. Desuden tomografi indebærer indsamling af billeder af vippede enheder, med den tilsyneladende tykkelse af prøven stiger med hældningsvinklen. Selvom uelastisk spredning kan filtreresunder anvendelse energi filtre, er den kritiske mængde af elektroner, der er nødvendige for høje SNR billeder knapt nået i TEM. Derfor har tykke biologiske prøver kun været undersøgt under anvendelse af sektionering 4.
Nogle prøver kan ikke skåret: nogle måske nedbrydes, når de er skåret, og andre har brug for at blive undersøgt i deres helhed for at forstå deres kompleksitet. En alternativ tilgang er at anvende TEM i scanningsfunktion 5, 6, 7, 8. Ved scanning transmission elektronmikroskopi (STEM), den optiske vej af elektronerne er anderledes end i konventionel TEM. Elektroner passerer gennem prøven uden spredningen kan afhentes på den optiske akse med en lys-felt (BF) detektor 9, mens de spredte elastisk kan opsamles i en bestemt vinkel fra den optiske akse med en mørk-felt (DF) detektor.Den anden fordel ved STEM er, at den fokuserede elektronstrålen scannes ved overfladen af prøven, således at pixel-for-pixel samling af billederne. Selvom elektronstrålen udvider, mens den passerer gennem prøven 10, denne særlige indsamlingsordning er mindre følsom over for uelastisk spredte elektroner end konventionel TEM. Desuden er der ingen objektiv post-modellen i STEM og derved undgå de kromatiske aberration, der kan opstå i TEM. Kameraet længde kan justeres, således at BF detektor hovedsagelig detekterer spredte elektroner. Brug af DF-detektor til at studere tykke prøver anbefales ikke på grund af multipel spredning, der producerer unøjagtige billeder. I stedet kan BF detektor anvendes 11. Mens STEM kan producere høj SNR billeder, det har en relativt lav dybde-of-field på grund af den relativt høje beam konvergens i forhold til TEM, reducere mængden af dybdegående information, der kan udvindes fra tykprøver. I tilfælde af aberration-korrigeret STEM mikroskoper, hvor konvergensen vinkel kan være så højt som 30 mrad kan dybden-på-felt være så lav, at de oplysninger, der er i fokus stammer fra et fokalplan på kun nogle få nanometer . Opsætning af elektronstrålen i paralleldrift øger dybde-på-felt af elektronstrålen til skade for beslutningen 12. Men denne opsætning er ikke altid muligt.
Når det er nødvendigt at anvende en konvergent elektronstråle, skal der anvendes teknikker, der forbedrer dybde-på-felt af elektronstrålen når man studerer tykke prøver. Nylige undersøgelser har rapporteret erhvervelsen af flere billeder på forskellige fokale planer i hele prøven for at genvinde den maksimale mængde i fokus information 13, 14. De to undersøgelser beskriver forskellige måder at håndtere oplysninger fra de forskellige fokalplaner. Hovden et al.kombineret i Fourier rum de billeder, der blev indsamlet på forskellige brændpunktsflader, og den endelige rekonstruktion blev opnået direkte fra 3D inverse Fouriertransformation 13. I modsætning hertil Dahmen et al. udviklet en konvergent stråle rekonstruktion motor til at rekonstruere i det virkelige rum 3D volumen fra de forskellige fokalplaner 14. Vores laboratorium har også udviklet en metode til billeddannelse tykke biologiske prøver. Vores strategi var forskellig fra de to metoder, der er beskrevet ovenfor i at vi fusionerede de oplysninger, der er i fokus i de forskellige fokalplaner og rekonstrueret den endelige 3D volumen i det virkelige rum ved hjælp af en parallel stråle projektor 15. Vores mål var at udvikle en fremgangsmåde, der nemt kan udføres i enhver elektronmikroskopi laboratorium. Til dette formål, vi havde til formål at indsamle de centrale billeder i en begrænset mængde tid, der kan sammenlignes med den tidsramme konventionelle tomografi eksperimenter. Desuden er vores foreslåede metode could tilpasses til anvendelse med forskellige typer af tilpasning og genopbygning software.
I forbindelse med vores publikation fra 2015 15, vi ønskede at visualisere og karakterisere inddrivelse af dybden-på-felt, så vi brugte en stor konvergens semi-vinkel på 25 mrad. Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til at udføre gennemgående omdrejningspunkt billeddannelse i STEM efter den metode udviklet i vores laboratorium i 2015 15, og vi præsenterer, hvordan data fra 2015 blev behandlet. Denne metode genopretter i fokus oplysninger fra flere fokalplaner gennem en tyk (750 nm) biologisk prøve og giver høj kvalitet 3D rekonstruktioner. Hvor det er relevant, er forskellene i denne metode versus de metoder, som andre grupper også præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Se de sikkerhedsdatablade (MSDS'er) af de forskellige reagenser før du bruger dem. Flere af de kemikalier, der anvendes under forberedelsen er giftige, kræftfremkaldende, mutagene og / eller reproduktionstoksiske. Brug personlige værnemidler (handsker, kittel, fuld længde bukser, og lukkede toe sko) og arbejder under en emhætte, mens håndtering af prøven. Sektionering af prøven med en ultramikrotom indebærer brug af skarpe instrumenter, og omhyggelig brug af disse værktøjer er obligatorisk. I de nedenfor beskrevne trin, forfatterne antager, at prøven er en cellekultur prøve. Protokollen kan være nødvendigt at modificeres i overensstemmelse med den prøvetype, især centrifugeringstrin.
1. Fremstilling af buffere og blandinger
- Forbered phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, og 1,76 mM KH 2 PO 4).
- Fremstille opløsninger indeholdende 30%, 50% og 70% ethanol i PBS i prøven dehydrering. Udføre prøven dehydrering ved gradvist at inkubere prøven i stigende ethanolkoncentrationer.
- Forbered epoxyharpiks ved at blande bisphenol-A- (epichlorhydrin) (20 ml), dodecenyl ravsyreanhydrid (9 ml), methyl-5-norbornen-2,3-dicarboxylsyre (11 ml), og 2,4,6-tris ( dimethylaminomethyl) phenol (0,7 ml); andre blandingsforhold kan anvendes afhængigt af den ønskede hårdhed af harpiksen.
- Fremstille opløsninger indeholdende 30%, 50% og 70% epoxyharpiks i ethanol for prøve indlejring. Udfør harpiks indlejring ved gradvist at inkubere prøven med stigende harpiks koncentrationer.
BEMÆRK: De mængder af de fremstillede opløsninger afhænger af den type prøve, der er undersøgt. er behov for flere løsninger til væv end for cellekulturer.
2. Fiksering og farvning af prøven
- Centrifugeres cellekulturen i 5 minutter ved 5.000 x g. Udfør alle de følgende centrifugeringer med de samme betingelser.
- Supernatanten fjernes, og fastsætte cellepelleten ved resuspendering det i PBS (1 ml) med 4% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter (figur 1A). Alternativt fikseres cellerne ved 4 ° C natten over eller i løbet af weekenden.
- Efter centrifugering, supernatanten fjernes og vaskes pelleten 3 gange med PBS (1 ml) til helt at fjerne fikseringsmiddelpartiklerne midler.
- Post-fix prøven med 1% OsO4 i PBS (1 ml) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Efter centrifugering, supernatanten fjernes og vaskes pelleten 3 gange med PBS (1 ml) for fuldstændigt at fjerne OsO4. Deaktiver Oso 4 i olie og discard.
- Tilsæt 2% uranylacetat i PBS (1 ml) som et kontrastmiddel og inkuberes prøven i 30 minutter ved stuetemperatur (figur 1 B).
- Efter centrifugering, supernatanten fjernes og vaskes pelleten 3 gange med PBS (1 ml) for at fjerne det ubundne uranyl acetate; uranylacetat indeholder radioaktive grundstoffer og skal bortskaffes på en bin dedikeret til radioaktivt affald.
BEMÆRK: inkubationstider kan ændres efter størrelsen af prøven. For eksempel, fiksering og farvning af tykkere prøver, såsom væv prøver, kræver længere inkubationstider. Længere inkubationstider kan også være bedre for dehydrering og integreringstilladelserne trin. Uranylacetat kan erstattes af en "uranyl-mindre" opløsning, der indeholder Gadolinium salte.
3. Prøve Dehydrering
- Efter centrifugering, supernatanten fjernes, og inkubere prøven i 30 minutter ved 4 ° C i PBS (1 ml) med 30% ethanol (figur 1C).
- Gentag trin 3.1 under anvendelse af opløsninger med gradvist stigende ethanol koncentrationer (50%, 70% og op til 100%). I løbet af disse dehydrering trin, vedligeholde prøven ved 4 ° C for prøve præserveringsformål.
- Efter centrifugering, kasseres supernatant og pellet resuspenderes i ren ethanol (1 ml); inkuber natten over ved 4 ° C.
4. Resin Indlejring
- Efter centrifugering, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i ethanol med 30% epoxyharpiks (1 ml) i 30 minutter ved stuetemperatur (figur 1 D).
- Gentag trin 4.1 under anvendelse af opløsninger med gradvist stigende epoxyharpiks koncentrationer (50%, 70% og op til 100%).
- Efter centrifugering, supernatanten, og pellet resuspenderes i ren epoxyharpiks (1 ml); inkuber natten over ved stuetemperatur. Tilstedeværelsen af hærdende DMP-30 kan udløse polymeriseringen af harpiksen; hvis dette sker, udarbejde to partier af epoxyharpiks, en med og en uden DMP-30.
- Efter centrifugering, pellet resuspenderes i 200 pi af ren epoxyharpiks (indeholdende hærderen) i en plast kapsel; prøven skal være i bunden af den plasthætte.
5. Harpiks polymerisation
- jegncubate plast kapsel indeholdende prøven i en inkubator indstillet til 60 ° C i 48 timer; andre former for harpiks kan polymerisere med forskellige indstillinger.
- Fjern kapslen fra inkubatoren og kontrollere, at harpiksen er polymeriseret; harpiksen skal være hårdt, hvis tryk mod en hård overflade.
- Tilføj ren epoxyharpiks (indeholdende hærderen) oven på den polymeriserede harpiks indeholdende prøven; denne ekstra lag af harpiks vil gøre det lettere at skære prøven. Inkuber kapslen ved 60 ° C i 48 timer.
6. Prøve Sektionsinddeling
- Monter prøve på hovedet i en prøveholder, så prøven er mod toppen, og sæt det på den trimning blok af ultramikrotom. Stramt låse håndtaget for at fastgøre trimning blok til ultramikrotom.
- Brug af et barberblad eller et lignende skarpt skærende instrument, skåret ud plast kapsel at adskille den fra den polymeriserede harpiks. Skær harpiksen således at prøven er indeholdeed i harpiks i nogenlunde form som en pyramide. Der er ikke behov for at fjerne hele plast kapsel; kun fjerne den del, der dækker det polymeriserede prøve.
- Tag kapslen og prøven indehaveren off af trimning blokken og installere dem på den bevægelige arm ultramikrotom.
- Installer en trimning kniv på knivblok og præcist trimme ansigter pyramiden. Brugen af kikkert tilrådes at give en perfekt form til pyramiden; jo bedre pyramiden, jo bedre sektionerne vil være.
- Tag den trimning kniv og erstatte det med en histologi kniv, der kan bruges til at skære sektioner, der er tykkere end 0,5 um.
- Efter fyldning af kuvetten ifølge histologi kniv med den korrekte mængde vand, bringe den skærende kant af kniven til overfladen af prøven og bruge kikkert til at justere kapslen stigningsvinkel således at kniven vil skære vinkelret på pyramiden.
- Justér skærehastigheden overensstemmelse med den ønskedeafsnit tykkelse at inddrive homogene sektioner.
- Lad afsnittet flyde over vandet og fiske den med en løkke.
- Flyt sløjfen mod en elektronmikroskopi kobbernet, der er blevet anbragt oven på filterpapir.
BEMÆRK: Gitteret skulle have været behandlet tidligere at øge sin hydrofilicitet. Dette kan udføres med et gitter-overtrækning pen. - På grund af vandabsorption filterpapiret, lad afsnittet klæbe til gitteret. Lad det tørre i nogle minutter, før du sætter det i elektronmikroskop.
7. Design af Through-omdrejningspunkt Tilt-serien
- Saml gennemgående fokale billeder ved konstant fokus intervaller.
BEMÆRK: gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien består af et sæt af gennemgående fokale billeder, der er indsamlet på hver hældningsvinkel tilt-serien. Hele fokus amplitude bør være tilstrækkelig til at dække hele tykkelse prøven. - Bestemme værdien af fokusintervallet. Hvis intervallet er lig med depth-på-felt, indsamle hele prøven i fokus; denne indstilling repræsenterer den højest mulige prøveudtagning. Hvis intervallet er større end dybden-på-felt, vil nogle dele af prøven ikke skal erhverves i fokus, hvilket betyder, at nogle dele af prøven ikke vil blive indsamlet i fokus.
- Beregn dybde-på-felt af en elektronstråle fra elektronens bølgelængde og konvergens semi-vinkel elektronstråle. Ud fra følgende betragtninger bølgelængden af elektroner er direkte forbundet med acceleration spænding, bruge konvergens semi-vinkel leveres af elektronmikroskop producenten eller bestemme den eksperimentelt fra diffraktionsmønsteret af en kendt prøve 16. Fordi elektroner accelereres ved en bølgelængde λ ramt prøven med en konvergens semi-vinkel α i et elektronmikroskop, bruge følgende ligning til at bestemme dybden-på-felt (DOF):
- Designomdrejningspunktet serier, således at hele fokus amplitude vil dække prøven ved dens maksimale tilsyneladende tykkelse (dvs. på sit højeste tilt).
BEMÆRK: En 0,75 um tyk prøve vil have en tilsyneladende tykkelse på 2,19 um ved en 70 ° hældning, så fokus amplitude bør være større end 2,19 um. Til denne prøve, hvis fokus interval fastlagt ovenfor er lig med 50 nm, vil det kræve 44 billeder (2,19 um / 50 nm) til at dække prøven på sit højeste tilsyneladende tykkelse. Hele fokus amplitude er lig med værdien af fokusintervallet multipliceret med antallet af fokale trin. På det højeste tilt (θ), er prøven tilsyneladende tykkelse defineret som følgende:
8. Prøve Imaging
BEMÆRK: Det er uden for rammerne af denne protokol til at beskrive, hvordan man opsætter et elektronmikroskop i STEM-tilstand; de fleste af disse oplysninger kan findes in håndbogen leveret af elektronmikroskop producenten. Men være opmærksom på følgende: i) stedet størrelse skal vælges i overensstemmelse med den ønskede forstørrelse; ii) Ronchigram skal være godt alliancefrie; og iii) i BF-tilstand, skal kameraet længde justeres til at vælge uspredt elektroner og samtidig opretholde en god belysning af detektoren. Harpiksafsnittene aflejret på elektronmikroskopi kobbergitre bør belyses før billedoptagelse at forhindre krympning. Resin svind og opladning effekter kan forveksles under erhvervelse billede. Brugen af en objektiv objektivets blænde kan forbedre prøve stabilitet ved opladning effekter opstår. Men i det konkrete tilfælde med STEM opsætninger, målet blænde er ikke kompatibel med HAADF imaging tilstand, og meget små objektive åbninger er ikke kompatible med BF imaging mode.
- Brug lav forstørrelse (ca. 20.000 x i STEM), bladre gennem prøven og find området af interesse.
- Juster than eucentric højde (Z-aksen), således at området af interesse ikke glider væk under rotation af prøven.
- Kontroller, at formålet med interesse vil forblive synlige i hele tilt rækkevidde.
- På grund af det store antal billeder, erhvervet under en gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien, skal du bruge en automatisk samling software. Brug enten en kommerciel løsning eller designe en brugerdefineret dataindsamling software, hvis det ønskes. Sørg for, at software program er i stand til at udføre følgende tre trin:
- Spor og fokusere som i en standard tilt-serien indsamlingsordning.
- Sørg for, at gennem-fokal billeder overlapper med Z-positionen af prøven.
- Automatisk erhverve en række gennemgående omdrejningspunkt billeder på hver tilt vinkel.
- Giv softwareprogrammet de vigtigste parametre for den gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien (dvs. fokale intervaller, omdrejningspunkt trin, minimum tilt vinkel, maksimal hældning vinkel, tilt step, og scanning hastighed).
- Startbilledsamling processen og vent til programmet for at afslutte.
9. Billedbehandling
BEMÆRK: I denne protokol, er det gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien behandling udføres ved hjælp af ImageJ plugins 17. Supplerende data 1 viser en ImageJ makro til tilpasningen trin (Turboreg) og for at fusionere i fokus oplysninger (Extended Dybdeskarphed) for en gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien designet med tre indsatsområder værdier.
- Juster billederne indsamlet på samme tilt vinkel (dvs. de gennemgående fokale billeder). Da billederne ikke har den samme i fokus oplysninger, de ikke nærer de samme funktioner for tilpasning; udføre tilpasning ved at tilpasse tilstødende billeder to og to (dvs. efter en pyramideformet hierarki, med de nærmeste fokus prisen først) ved hjælp Turboreg 18, en ImageJ plugin.
- Konsekvent kontrollere justeringen af de gennemgående fokale billeder på hver tilt vinkel.Stak de justerede gennemgående fokale billeder for at forbedre visuel inspektion.
BEMÆRK: Kun den zone, der er i fokus bør bevæge sig, mens du browser gennem stakken. Præcis justering er det vigtigste, da det følgende trin består i inddrivelse af de oplysninger, der er i fokus fra forskellige billeder. - Flet de oplysninger, der er i fokus ved hjælp Udvidet Dybdeskarphed 19, en ImageJ plugin; dette vil i sidste ende genererer et enkelt billede fra stablen af billeder. Flere indstillinger kan anvendes under dybde-of-field opsving, men bruger de højeste indstillinger for at bevare oplysninger billedet.
BEMÆRK: tilt-serien består nu af et enkelt billede pr tilt vinkel, hvert billede indeholder den i fokus oplysninger udvundet fra gennemgående fokale billeder. - Behandle dataene.
BEMÆRK: Standard værktøjer til justering og genopbygning kan anvendes, da de data, nu er blevet reduceret til en standard tilt-serien. I denne protokol, TomoJ er osed for tilpasning af data og genopbygning af data 20, 21. Flere detaljer om, hvordan du bruger TomoJ kan findes i den originale publikation 22. - Udfør fine justering af tilt-serien.
BEMÆRK: En god strategi er at bruge guld kugler som referencemærker markører til præcist at spore skift mellem billeder. Lokale minimumsværdier kan også anvendes, hvis guldperler ikke kan sættes til prøven. - Udfør en 3D rekonstruktion af justeret data; flere algoritmer er tilgængelige til udførelse af rekonstruktioner i virkeligt rum eller Fourier space, hver med fordele og begrænsninger.
- Hvis den endelige justering af tilt-serien er dårlig, foretage nogle forbedringer ved at optimere de indledende skridt. Gentage tilpasningen trin, hvis den endelige 3D-rekonstruktion er sløret eller deformeret; i praksis, jo større er antallet af indsamlede brændpunktsflader, jo bedre kontrast og detaljer af 3D-rekonstruktion.
BEMÆRK: SeVeral softwareprogrammer kan anvendes til at behandle de gennemgående fokal tilt-serien. Men de værktøjer, der anvendes i denne protokol blev valgt, fordi der i vores erfaring, at de udførte bedst. Turboreg 18 klarede sig bedre med hensyn til at tilpasse billederne, når en gradient af fokus var til stede. Mere information kan findes på den dedikerede hjemmeside 23. Den udvidede Dybdeskarphed plugin 19 udført meget godt med hensyn til inddrivelse af det i fokus information fra forskellige billeder, mens andre værktøjer resulteret i synlige pixels modifikationer. Mere information, især med hensyn til manuskriptskrivning, kan findes på denne særlige websted 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores undersøgelse blev elektroner accelereret til 200 kV i feltemissions gun transmissionselektronmikroskop. Billeder blev indsamlet i STEM BF-tilstand ved hjælp af en 20-mikrosekunder opholdstid. Med hensyn til udformningen af den gennemgående fokal tilt-serien, fandt vi at fokus intervaller på 150 nm gav tilfredsstillende resultater for ultrastrukturelle undersøgelse af en 750 nm tyk biologisk prøve-selvom dybde-på-felt af elektronstrålen var kun 3 nm-da vi brugte en meget stor konvergens semi-vinkel på 25 mrad.
Prøven analyseres i denne rapport er Trypanosoma brucei, en encellet eukaryot hvis flagel intensivt studeret, fordi denne organel er bemærkelsesværdigt bevaret fra protister til pattedyr 25. Cellerne blev behandlet som præsenteres i prøveforberedelsen protokollen, og vi fokuserede den strukturelle analyse af flagellært lomme af T. brucei (
Sammenlægningen af i-fokus oplysninger kan bedre visualiseres ved at fremhæve de højfrekvente områder af gennem-focal tilt-serien billeder (hvide pixels i figur 2F, G og H). Den ImageJ kommandoen "Find Edges" var osed i den foreliggende undersøgelse. Denne kommando bruger en Sobel filter til at detektere ændringer i tilstødende pixel intensiteter. Forskydningen af den detekterede højfrekvente område kan observeres fra et billede til det andet. På billedet, hvor det i fokus oplysninger er blevet lagt sammen, de høje frekvenser span meste af billedet (Figur 2I). Denne metode tillader kontrol af god behandling af den gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien.
Brug gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien, er ekstra i fokus oplysninger, der indsamles og anvendes under 3D genopbygningsprocessen. Dette giver større kontrast og SNR og reducerer sløring virkninger observeret i 3D rekonstruktioner af dybde-of-field-begrænset billeder 15. I Fourier plads, er ekstra information inddrives i forhold til en klassisk tilt-serien indsamlingsordning, hvor kun på brændplanet indsamles 13. Samlet set kvaliteten i hele 3D rekonstruktion er mere isotrop i forhold til en klassisk indsamlingsordning tilt-serien.
Figur 1: Billeder præsenterer de forskellige trin i den biologiske forberedelse prøve protokol. Prøven forberedelse protokol kan opdeles i fire lysnettet trin. Prøven A) fast i paraformaldehyd og glutaraldehyd, B) post-fikseret i osmiumtetroxid og sammenholdes med uranylacetat, C) dehydreret i ethanol, og D) indlejret i harpiks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en konventionel prøveforberedelse protokol sammen med en trin-for-trin guide til at udføre 3D-analyse på tykke biologiske prøver ved anvendelse STEM gennemgående omdrejningspunkt tomografi. Harpiks indlejring af biologiske prøver har været anvendt i årtier 26, og alternative protokoller, som er tilpasset forskellige prøver kan findes i hele litteraturen 27. I modsætning hertil imaging tykke prøver i STEM hjælp gennem fokus metoder en ny virksomhed, og de metoder, vil højst sandsynligt blive forbedret, da det bliver mere udbredt.
Formålet med dette arbejde var at beskrive en prøveforberedelse protokol og, mere specifikt, billedbehandling betingelserne for at udføre gennemgående omdrejningspunkt erhvervelse tilt-serie i STEM med udstyr, der er i øjeblikket tilgængelig og i en rimelig tid. Derfor blev store fokus intervaller brugt. Faktisk er der ikke enighed om, hvor tætfokalplaner bør være til billeddannelse en tyk prøve med STEM for gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien. Det tager normalt op til flere sekunder til at indsamle STEM billeder og en hel konventionel tilt-serien kan tage timer at gennemføre. Som en proof-of-concept, er det muligt at samle flere hundrede eller endda tusindvis af billeder. Det er imidlertid klart, at lange indsamling gange ikke er egnet til daglig brug. Beam stabilitet og prøve afdrift skal tages i betragtning ved udformningen så lange eksperimenter. Endvidere lange indsamling gange rejser spørgsmålet om akkumulerede elektron dosis. Således for tiden, STEM gennemgående omdrejningspunkt tilt-serien er kun egnet til studiet af beam-resistente prøver, såsom harpiks-indlejret biologiske prøver eller uorganiske materialer, primært på grund af den betydelige elektron dosis, der kræves. På grund af den afvejning mellem erhvervelse tid og kvaliteten af den endelige 3D-rekonstruktion, anbefaler vi at bruge nogle få gennemgående omdrejningspunkt intervaller i projekter, hvor der ikke kræves høj opløsning, ennd vi anbefaler at bruge en større mængde gennem-fokal intervaller i projekter, hvor der kræves høj opløsning.
Der er en mangel på konsensus om de specifikke skridt i denne metode, fordi det er nyt. Det er imidlertid klart, at flere trin er afgørende for høj kvalitet rekonstruktioner fra STEM gennemgående fokal tilt-serien datasæt. Først tilpasningen af de centrale billeder på hvert hældningsvinkel skal omhyggeligt udført, som påpeget i de tre oprindelige artikler, der beskriver gennemgående omdrejningspunkt billedsamling 13, 14, 15. Selvom billeder indsamlet ved forskellige fokale værdier ikke deler fælles information, Turboreg fortsat en god løsning til nøjagtig, automatisk justering af billeder. For det andet, sammenlægning af de centrale billeder, som udføres i denne protokol, har den fordel, at generere et enkelt billede pr tilt vinkel, som er let håndteres af enhver tilt-serien alignling og 3D-rekonstruktion program. Den udvidede Dybdeskarphed plug-in blev oprindeligt designet til lysmikroskopi billeder; Alligevel synes det at være den bedste løsning til at sammenlægge i fokus information fra elektronmikrofotografier 28. En alternativ løsning er at betragte hele sæt billeder som en enkelt tilt-serie datasæt med flere billeder pr tilt vinkel, på samme måde til, hvad der blev gjort ved Hovden et al. 13 og Dahmen et al. 14. Dette kræver anvendelse af Fourier-baserede rekonstruktionsalgoritmer 13 eller Ettention, som blev udviklet af Dahmen et al. 29, og som er den eneste 3D-rekonstruktion software, der kan rekonstruere 3D volumener fra billeder indsamlet ved forskellige fokale værdier i det reale rum. Især vil sådanne alternative løsninger nødvendiggøre en ekstra tilpasning skridt i den fokale retning (Z-aksen), der kan producere forvirrende results, der er i modstrid med de ude af fokus intervaller valgt under billedsamling, som diskuteret i Dahmen et al. 14. Sammenlægningen af i-fokus oplysninger, som præsenteres i denne protokol, har den fordel, at generere et billede, som hvis de blev indsamlet ved hjælp af en parallel og derved undgå denne ekstra tilpasning skridt i Z-retningen.
Gennem-omdrejningspunkt er blevet udviklet tilt-serien metoder til at studere tykke prøver (ca. 1 um). Den væsentligste begrænsning af disse metoder er, at de ikke kan anvendes til at studere prøver tykkere end flere mikrometer, idet elektronstrålen ikke kan trænge sådanne prøver. Denne begrænsning kommer fra den gennemsnitlige frie vej af de elektroner, der er afhængig af acceleration spænding. Selvom meget høj spænding (dvs. 1000-kV) elektronmikroskoper kan anvendes til afbildning af eukaryote celler 30, meget tykke prøver kræver stadig anvendelse af andre teknikker, såsom fokusererd ionstråle eller seriel blok-face scanning elektronmikroskopi 31, 32. Disse fremgangsmåder genererer anisotrope rekonstruktioner, der kan betragtes stakke af billeder, fordi Z-aksen, der defineres som skæredybde fremgangsmåden, ikke svarer til X- og Y- akserne. Disse teknikker kan ikke bruges til høj opløsning undersøgelser.
I 2014 og 2015, tre originale artikler rapporteret forskellige metoder til billeddannelse tykke prøver 13, 14, 15. Siden da har kun få studier brugt nogen af disse metoder til at studere tykke prøver 33. Forbedringer i de metoder, vil bidrage til at generalisere gennemgående omdrejningspunkt billeddannelse i STEM. Især i biovidenskab, gennemgående omdrejningspunkt metoder skal optimeres for at observere prøver under kryogene betingelser. Dette er en stor udfordring, da kryogene prøversærligt følsomme over for elektron dosering, og gennemgående fokus metoder kræver mange billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al.
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
- Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
- Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
- Kohl, L., Bastin, P.
- Luft, J. H.
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al.
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
