रीटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के परिभाषित सैकट्स के सिंगल-सेल आरएनए-सैक
Summary
यहां, हम अलगाव से पहले न्यूरोनल सेल प्रकारों को वर्गीकृत करने के लिए और एकल-कोशिका ट्रांसस्क्रिप्टम के बाद के लक्षण वर्णन के लिए एक संयोजी दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल सफल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक) के लिए नमूने तैयार करने का अनुकूलन करता है और सेलुलर विविधता की बढ़ी हुई समझ के लिए विशेष रूप से तैयार की गई एक पद्धति का वर्णन करता है।
Abstract
सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों की खोज सेलुलर फ़ंक्शन और सेलुलर विविधता की उत्पत्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। न्यूरोनल विविधता की बेहतर समझ के लिए हाल ही में एक धक्का के साथ, यह महत्वपूर्ण है कि जिन जीनों की अभिव्यक्ति कोशिकाओं के विभिन्न उप-प्रजातियों को परिभाषित करती है। रेटिना केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र की विविधता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है, क्योंकि यह कई प्रमुख सेल प्रकारों से बना है। कोशिकाओं के प्रत्येक प्रमुख वर्ग के अध्ययन से आनुवंशिक चिह्नक उत्पन्न हुए हैं जो इन आबादी की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं। हालांकि, कोशिकाओं के कई उपप्रकार इन प्रमुख रेटिना सेल कक्षाओं में से प्रत्येक के भीतर मौजूद हैं, और इन उपप्रकारों में से कुछ आनुवंशिक मार्करों को जानते हैं, हालांकि बहुत से लोगों को आकृति विज्ञान या फ़ंक्शन द्वारा वर्णित किया गया है। व्यक्तिगत रेटिना उपप्रकार के लिए आनुवंशिक मार्करों का ज्ञान विशिष्ट दृश्य कार्यों से संबंधित मस्तिष्क लक्ष्यों के अध्ययन और मैपिंग की अनुमति देगा और जीन नेटवर्क में अंतर्दृष्टि भी उधार दे सकता हैसेलुलर विविधता को बनाए रखें उपप्रकार के आनुवंशिक चिह्नकों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान अवसरों में कमियां आती हैं, जैसे कि क्रमशः निम्नलिखित सेल प्रकार का वर्गीकरण। यह डेटा विश्लेषण के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है और यह सुनिश्चित करने के लिए कठोर सत्यापन विधि की आवश्यकता होती है कि समूहों में एक ही फ़ंक्शन के कक्ष होते हैं। अलगाव और अनुक्रमण से पहले सेल की आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता की पहचान करने के लिए हम एक तकनीक का प्रस्ताव करते हैं, जो उपप्रकार-विशिष्ट मार्करों की आसान पहचान की अनुमति देगा। यह तकनीक गैर-न्यूरोनल सेल प्रकारों के साथ-साथ मामूली भिन्नता वाले कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी तक भी बढ़ सकती है। यह प्रोटोकॉल उत्कृष्ट-गुणवत्ता वाले आंकड़ों की पैदावार करता है, क्योंकि कई पुस्तकालयों ने एकल कोशिकाओं के लिए 20 मिलियन से अधिक पढ़ने की गहराई प्रदान की है। यह पद्धति एकल-कक्ष आरएनए-सैक द्वारा प्रस्तुत कई बाधाओं पर काबू पाती है और शोधकर्ताओं के लिए सरल और उच्च कुशल तरीके से सेल प्रकार के प्रोफाइल के लिए उपयुक्त हो सकता है।
Introduction
न्यूरोनल विविधता पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में मनाई जाती है, विशेष रूप से कशेरुकात्मक रेटिना में, एक अति विशिष्ट ऊतक जिसमें 1 ग्लिलियल और 6 न्यूरोनल सेल प्रकार होते हैं जो कि रेटिना प्रजनन कोशिकाओं 1 , 2 , 3 की एक आबादी से पैदा होती हैं। कोशिकाओं के कई उपप्रकार कार्यात्मक रूप से वर्गीकृत किया जा सकता है, morphologically, और आनुवंशिक रूप से इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उनके पहचान योग्य कार्यात्मक और / या रूपात्मक विशेषताओं के लिए सेल प्रकार की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता को टाई करना है। कोशिकाओं के वर्गीकरण के लिए कई जीनों की पहचान की गई है, लेकिन कई उपप्रकार अप्रभावी हुए हैं, क्योंकि वे समग्र आबादी के एक छोटे से अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन विशिष्ट उपप्रकारों के भीतर जीन की पहचान ने रेटिना के भीतर न्यूरोनल विविधता की अधिक समझ के लिए अनुमति दी है और यह भी कहीं और तंत्रिका कोशिकाओं के विविधीकरण पर प्रकाश डालें। फूरथेमोर, एकल सेल अध्ययन, नए सेल प्रकारों के उजागर होने की अनुमति देता है, जो समग्र आबादी 4 , 5 , 6 , 7 के बीच उनके कम प्रतिनिधित्व के कारण अनदेखी की गई हो सकती है।
एकल सेल ट्रांस्क्रिप्टमिक्स के लाभों में से एक यह है कि अद्वितीय मार्कर या मार्करों के संयोजन जो एक विशेष सेलुलर उपप्रकार को परिभाषित करते हैं, उन्हें खोजा जा सकता है। ये तब अलग-अलग जोड़तोड़ के लिए उस सेल प्रकार पर आनुवंशिक पहुंच प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम इस प्रोटोकॉल का प्रयोग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के एक सबसेट के सेल प्रकार-विशिष्ट जीनों को चिह्नित करने के लिए कर रहे हैं जो फोटोपैग्मेंट मेलानस्पिन को व्यक्त करते हैं। मेलानोस्पिन-व्यक्त रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग इन कोशिकाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है, क्योंकि वे ज्ञात जीन की अभिव्यक्ति के कारण एक साथ क्लस्टर होते हैं। दिलचस्प है, इस सेल पॉपु के पांच ज्ञात उपप्रकार हैंमाउस रेटिना 8 में लेशन इस प्रकार, प्रत्येक प्रकार की कोशिकाओं से आरएनए को अलग करने के लिए, हमने कोशिका अलगाव के पहले प्रत्येक उपप्रकार की पहचान करने के लिए ट्रांसजेनिक मॉडल के भीतर स्थूल संरचनाओं को स्थापित किया है। यह तकनीक ऊतक विघटन की आवश्यकता के बिना, कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के साथ-साथ रेटिना से सीधे उनके अलगाव के लिए अनुमति देता है, जो कटे हुए डेंड्राइट 9 के कारण कोशिकाओं और प्रदूषण के भीतर तनाव प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है।
पिछले कुछ सालों में आरएएनए-सैक विधि विकसित करने के लिए नई तकनीकें सामने आई हैं। ये उपकरण 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 के हाथ में प्रश्न के मुकाबले अधिक से अधिक सेल अधिग्रहण और अधिक लागत दक्षता की अनुमति देते हैं। हालांकि, जबकिये तकनीक उत्कृष्ट कदम पत्थर रही हैं, अभी भी कई बाधाएं हैं जो इस प्रोटोकॉल को संबोधित करने में सक्षम हैं। सबसे पहले, मौजूदा प्रक्रियाओं में से कई अलग-अलग ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करते हैं और सेल वर्गीकरण निर्धारित करने के लिए या तो मुख्य घटक विश्लेषण या पदानुक्रमिक क्लस्टरिंग का उपयोग करने का प्रयास करते हैं। उप-प्रकारों को वर्गीकृत करने के लिए इन उपकरणों पर भरोसा करने से विश्वसनीय परिणाम नहीं हो सकते हैं और ये किसी एक आनुवंशिक मार्कर के एक कार्यात्मक सेल प्रकार के संबंध के लिए इस डेटा को मान्य करने के नए तरीके खोजने के लिए बाध्य कर सकते हैं। अन्य प्रोटोकॉल में पृथक्करण की आवश्यकताएं कभी-कभी ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकती हैं और न्यूरोनल प्रक्रियाओं को अलग कर सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एमआरएनए का संभावित नुकसान हो सकता है। इसके अलावा, अलग-अलग कोशिकाओं की तैयारी में, तनाव की प्रतिक्रियाएं इन कोशिकाओं 14 के ट्रांसस्क्रिप्टम को प्रभावित करना शुरू कर सकती हैं। यह प्रोटोकॉल अलगाव से पहले कार्यात्मक सेल प्रकार का निर्धारण करके इन चुनौतियों का सामना करता है, और यह बेहतर एच रखता हैरेटिना ऊतक बरकरार रखकर कोशिकाओं के ईल्थ
एक तकनीक को 2014 में पेश किया गया था और लाइव कोशिकाओं 15 के ट्रांसस्क्रिप्टो के विवो विश्लेषण में शामिल किया गया था। यद्यपि यह तकनीक ऊतक को न्यूनतम यांत्रिक विघटन के साथ ट्रान्सस्क्रिप्टम की परीक्षा देने की अनुमति देती है, लेकिन इसमें विशिष्ट विशिष्ट प्रकार के कोशिकाओं को उनके विशिष्ट प्रतिलेखक माउस का उपयोग किए बिना उनके ट्रांसस्क्रिप्टमों की जांच करने से पहले ऊतक के भीतर वर्गीकृत करने की क्षमता नहीं होती है। हमारे प्रोटोकॉल के लिए एक विशिष्ट रिपोर्टर की आवश्यकता नहीं होती है, क्योंकि हम अपने अलगाव से पहले कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए सेल भरने और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करते हैं। इस पिछले प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि इसे फोटोएक्टिवेटबल तत्व को उत्तेजित करने के लिए एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य की आवश्यकता होती है, जबकि हमारे प्रोटोकॉल एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करने की अनुमति देता है, जो आसानी से उपलब्ध हैं या प्रत्येक प्रयोगशाला द्वारा अलग-अलग चुना जा सकता है। फिर भी, अन्य प्रयोगशालाओं ने विद्युत के दो तरीकों से विवाह किया हैसेलुलर विविधता के अध्ययन के लिए ओफ़िशियोलॉजी और ट्रांसस्क्रिप्टमिक्स पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का इस्तेमाल अपने अलगाव के पहले एक सेल के समारोह को चिह्नित करने के लिए अलग-अलग न्यूरॉन्स 16 पर किया गया है और, कुछ मामलों में, इन अध्ययनों के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण 17 के प्रयोग से पहले ही ऐसा किया गया है। वही जटिलताओं का सामना उन तरीकों से होता है, क्योंकि उन्हें ऊतक पृथक्करण या माइक्रोएरे तकनीक का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो उपलब्ध जांचों के नमूनों के संकरण पर निर्भर करता है। सबसे हालिया अग्रिमों में से एक पैच-सैक का विकास रहा है, एक तकनीक जो पूरे-मस्तिष्क स्लाइस 18 से कोशिकाओं को समझने के लिए पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और आरएनए-सैक तकनीक का उपयोग करती है। यद्यपि इस तकनीक की यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की समानताएं हैं, फिर भी यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमारे दृष्टिकोण से कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए ऊतक को बरकरार रहने की अनुमति मिलती है। यहां, हम अनुकूलन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैंइस गठबंधन का आयन, जो उच्च पढ़ने वाली गहराई और मैपिंग कवरेज प्राप्त करने के लिए आरएनए-सैक के उपयोग के लिए उच्च-गुणवत्ता, एकल-सेल पुस्तकालयों को उत्पन्न करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे प्रोटोकॉल एक त्वरित और आसान उपयोग मार्गदर्शिका के माध्यम से दर्शाता है, नमूना की छोटी चोट के साथ, उच्च गुणवत्ता वाली अनुक्रमण के लिए पहचाने गए आकृति विज्ञान कक्षाओं के एकल कक्षों को तैयार करने क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम नमूने तैयार करने और प्रबंधित करने में उनकी सहायता के लिए जेनिफर बेयर और ईनाट स्निर, साथ ही साथ आइवा इंस्टीट्यूट फॉर ह्यूमन जेनेटिक्स को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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