Introduction
Il percorso di segnalazione Notch dei mammiferi è omologa alla stessa via in Drosophila melanogaster e si compone di quattro recettori transmembrana Notch (Notch1-4) e cinque ligandi di membrana della Jagged (JAG1 & JAG2) e Delta-like (DLL1, 3, e 4) le famiglie 1. Notch viene avviata quando il recettore Notch su una cellula ricevente è vincolato da ligando su una cella di trasmissione 2. Nel corso di questo trans-attivazione, il Notch ligando legato alla membrana produce una forza che si estende sul Notch recettore di membrana 3, 4. La forza di stiramento del ligando di legame induce cambiamenti conformazionali del recettore Notch che facilitano scissione extracellulare del recettore da TNFalfa enzima di conversione (TACE) seguito da un evento clivaggio intracellulare mediato da un gamma-secretasi complesso (γ-secretasi) presenilina-contenenti. γ-secretasi rilascia la int Notchdominio racellular (NiCd), che trasloca nel nucleo dove forma un complesso trascrizionale con CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mente-like (MAML), e fattori specifici tipo di cellula a guidare l'espressione di geni bersaglio 5.
Gli elementi meccanici di risultato di attivazione del segnale di Notch nella necessità di metodi unici di attivazione Notch percorso in vitro. leganti Notch solubili possono legarsi ai recettori Notch, ma non riescono a produrre estende forze necessarie per il rilascio NiCd mentre allo stesso tempo inibizione competitiva del legame di ligandi Notch associati alle cellule. Così, l'aggiunta di ligandi solubili Notch a mezzo di coltura può attenuare Notch normale segnalazione 6, 7. Fortunatamente, leganti Notch possono indurre liberazione NICD se sono fissati ad un substrato adeguatamente rigida 5, 8, 9,10. Semina cellule su substrati di coltura ligando rivestite o l'applicazione di perline ligando rivestite di cellule in grado di attivare sia segnale di Notch, e la scelta tra i due dipende in primo luogo la tempistica desiderata della stimolazione Notch. Infatti, l'attivazione di Notch immediata temporanea, come sarebbe desiderato durante il punto medio di un saggio funzionale o differenziazione, Notch ligando può essere associato a agarosio perline, applicati alle cellule in coltura, e lavato in qualsiasi momento. Per ulteriori Notch sostenuta dall'inizio di un periodo di coltura, piastre di coltura di tessuto possono essere rivestiti con legante prima della semina cellulare.
Ai fini di questo protocollo, i metodi vengono effettuati utilizzando il mouse precursori degli osteoclasti, ma i metodi e le variazioni sui metodi qui descritti sono applicabili ad un'ampia varietà di tipi cellulari 6, 11, 12, 13, 14. Gli osteoclasti sono cellule terminalmente differenziate Linage ematopoietiche che sono responsabili per il riassorbimento del tessuto osseo, e sono implicati in molteplici disturbi della perdita di massa ossea 15. Così, studio in vitro della differenziazione degli osteoclasti dai loro precursori monociti / macrofagi lignaggio e dei meccanismi molecolari che controllano la loro funzione è essenziale per una migliore comprensione degli osteoclasti e sviluppo di nuove terapie osso-rigenerante. Mentre è ormai generalmente accettato che la segnalazione Notch gioca un ruolo positivo nella differenziazione e la funzione degli osteoclasti, variazioni sia la stimolazione di Notch e osteoclasti cultura precursore e la differenziazione ha portato a risultati contraddittori inizialmente 16, 17, 18, 19. Un esame più attento delle differenze nei metodi e l'uso di geneticamodelli sono notevolmente chiarito il ruolo della segnalazione Notch in osteoclastogenesis, ma l'applicazione di metodi di stimolazione e cultura Notch standardizzati potrebbero impedire tali controversie in studi futuri di segnalazione di Notch in altri tipi cellulari 20, 21, 22, 23.
Esistono diversi metodi per la coltura e differenziare precursori del mouse osteoclasti, e, come con vari metodi per stimolare segnalazione Notch, il metodo migliore dipenderà dalla domanda sperimentale. Qui, sarà presentato il nostro metodo preferito di coltura frazioni aderenti e non aderenti di cellule di midollo lavata dalle ossa lunghe del mouse. Questo metodo ha il vantaggio di richiedere essenzialmente alcun attrezzature specializzate e produrre cellule che sono applicabili ad una varietà di metodi di differenziazione.
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Protocol
Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità con i protocolli approvati dalla University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC).
1. Culture Media Preparazione
- Preparare α-MEM sciogliendo medium (MEM) in polvere essenziale minimo e 1,9 g di bicarbonato di sodio in 900 ml di H 2 O e integrare con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml calore siero fetale bovino inattivato. Sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron polietersulfone (PES).
- Preparare medio macrofagi, completandolo α-MEM con 35 ng / ml ricombinante topo macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF)
- Preparare medio degli osteoclasti, completandola medio macrofagi con 100 RANKL ng / ml
L'isolamento delle cellule 2. midollo osseo
- Riempire una siringa da 10 ml con un ago calibro 25⅝ per mouse con 10 ml di α-MEM. Euthanize topi via 10 min esposizione a CO 2 ad una portata di 1,3 L / min. Garantire la morte degli animali seguendo CO 2 l'esposizione con la dislocazione cervicale prima di procedere con la dissezione.
- Usando una tecnica pulita, sezionare e separeranno i tibie e femori. Disinfettare la pelle del mouse con il 70% di etanolo prima di fare un'incisione lungo la superficie anteriore di ogni arto posteriore per esporre la tibia e femore.
- Tagliare il ginocchio per liberare l'estremità distale del femore, e tagliare il femore più vicino al bacino possibili. Rimuovere il femore e pulire il tessuto più morbido possibile. Per rimuovere la tibia, tagliare la caviglia e rimuovere quanto più tessuti molli possibile.
- Tenere l'osso con una pinza e di midollo a filo in un tubo da 15 ml con 2,5 ml di temperatura ambiente α-MEM combinando vampate osseo da un singolo mouse in un unico tubo.
NOTA: Un rossore midollo successo cambierà la colorazione di tegli osso dal rosso al beige. - Lasciare che i detriti di depositarsi sul fondo della provetta e trasferire il surnatante in un ambiente pulito tubo da 15 ml avendo cura di evitare il trasferimento di eventuali detriti.
NOTA: Alcune cellule possono risolvere con i detriti osseo. Se è necessario un maggior numero di cellule, vampate osseo possono essere filtrati attraverso un filtro cella 70 micron in una provetta pulita 15 ml. - provetta da centrifuga (s) a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente a pellet cellule.
- Vacuum aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 0,5 ml di ammonio-cloruro-potassio (ACK) lisi buffer e incubare a 37 ° C per 3 minuti per lisare i globuli rossi.
- Aggiungere 10 ml di PBS direttamente su ACK-cell soluzione e centrifugare a 300 xg per 5 min.
NOTA: Il pellet cellulare precedentemente rosso dovrebbe essere beige. - Vacuum aspirare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di α-MEM, e la piastra in un piatto di coltura trattata mm tessuto 100. Incubare le cellule notte a 37 ° C in un umidificatatessuto cultura incubatore.
NOTA: Conteggio cellule non è necessario per questo passaggio. Durante questo tempo, cellule aderenti dal midollo osseo si attaccarsi alla superficie coltura; popolazioni di cellule di midollo osseo non aderenti rimarranno in sospensione. MCSF non è presente nel mezzo di coltura durante questo incubazione iniziale.
3. Arricchimento di osteoclasti Precursori
- Dopo incubazione durante la notte delle vampate di midollo, il trasferimento di cultura surnatante contenente le cellule non aderenti a un tubo da 50 ml.
NOTA: i piatti di coltura con cellule aderenti, tra cui le cellule del midollo mesenchimali progenitrici del midollo, può essere scartato o alimentati con fresco α-MEM, se lo si desidera per altri esperimenti.
NOTA: osteoclasti possono essere differenziati direttamente da queste cellule di midollo osseo non aderenti da essi placcatura in tessuto piatti di coltura trattata ad una densità di 4 x 10 5 cellule / cm 2 in terreno osteoclasti e medio rinfrescante ogni altro giorno per 5 giorni. Aggiungere α-MEM per soluzione di cellule non aderente ad un volume finale di 18 ml e M-CSF ad una concentrazione finale di 35 ng / ml. - Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare ciascuna a 6 piatti della cultura sospensione di 60 mm.
- Incubare le piastre per una notte a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura tissutale. Durante questo tempo, M-CSF stimolerà differenziazione dei macrofagi, che possono aderire anche a superfici di coltura trattato non-tessuto.
- Dopo l'incubazione durante la notte, ri-alimentazione precursori degli osteoclasti con 3 ml di mezzo macrofagi fresco. Questo rimuovere le cellule non aderenti che non sono differenziate in macrofagi.
- Continuare a cultura precursori degli osteoclasti a 37 ° C e 5% di CO 2 per 2 giorni o fino a quando le culture raggiungono circa il 70% di confluenza.
4. Osteoclasta Differenziazione
- Lavare precursori degli osteoclasti con 5 ml di PBS e il trattamento di cellule con 1 ml marine origine proteolitico / enzima collagenolitica a temperatura ambiente fino al cells possono essere sloggiati con lievi colpetti della piastra.
NOTA: Osteoclasta precursori possono essere sollevati solo se sono coltivate in piatti di sospensione; precursori attribuiscono troppo saldamente alle superfici di coltura di tessuti trattati da sollevare. Tripsina può attivare precursori degli osteoclasti e deve essere evitato. - Aggiungere 4 ml di α-MEM per ciascuno cellule piatto e trasferire in una provetta da 50 ml. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire le cellule ad una densità di 5 x 10 4 cellule / ml e aggiungere M-CSF ad una concentrazione finale di 35 ng / ml e RANKL ad una concentrazione finale di 100 ng / ml.
- Cellule Seed ad una densità di 2,6 x 10 4 cellule / cm 2 in piastre di coltura dei tessuti trattati e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura tissutale per 2 giorni. Differenziazione è tipicamente effettuata in piastre da 24 pozzetti, dove 5 x 10 4 cellule sono seminate in ogni pozzetto.
- 2 giorni dopo l'inizio delle cellule differenziazione, ri-alimentazione sostituendo medio di 1 ml osteoc frescaultima media.
NOTA: la differenziazione degli osteoclasti solito sarà completa entro 3 giorni. osteoclasti risultante può essere TRAP-macchiato per una facile quantificazione e analisi morfologica.
5. Stimolazione Continua di Notch segnalazione con superficie rivestita Jagged1
- Sospensione di capra anti-IgG umane Fc degli anticorpi in PBS ad una concentrazione di 10 ug / ml (1: 1.000 diluizione 10 mg / ml magazzino). Aggiungere la soluzione di anticorpi sulla superficie coltura ad una densità di 1,3 g / cm 2 e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Nel caso di piastre da 24 pozzetti, aggiungere 250 microlitri (2,5 mcg) per pozzetto.
- Aspirare pozzi vuoto e riempire con 1 ml di PBS. Ripetere questa operazione 2 volte.
- Sospendere ricombinante Jagged1-Fc proteina di fusione in PBS ad una concentrazione di 10 ug / ml. Aggiungere la soluzione Jagged1-FC alla superficie coltura anticorpi rivestita con una densità di 1,3 g / cm 2 e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. superfici Cultura rivestite con un anticorpo only possono essere usati come controlli.
- Aspirare pozzi vuoto e riempire con 1 ml di PBS. Ripetere questa operazione 2 volte. Mantenere PBS in pozzetti fino a poco prima cella semina per impedire loro di essiccazione.
- Seed 2.6 x 10 4 osteoclasti precursori / cm 2 su superfici rivestite. Notch sarà continuamente stimolata per almeno 3 giorni.
6. La stimolazione temporanea di Notch segnalazione con Perle Jagged1 rivestite
- Combinare il seguente in una provetta di dimensioni: 0,5 mg / cm 2 Jagged1-Fc, 21 microlitri / cm 2 perline proteina G agarosio, e PBS fino ad un volume finale di 1,5 ml. Per preparare un numero adeguato di perline Jagged1 per 1 pozzetto di una piastra ben 24, unire 1 mg Jagged1-Fc, 40 proteine ul G perline agarosio, e PBS a 1,5 ml.
- Incubare tubo con rotazione a 4 ° C per 2 ore.
- provetta da centrifuga a 300 xg per 1 minuto a perline pellet. perline risospendere in 1,5 ml di PBS. Ripetere questo lavaggioaltre 2 volte.
- Perline risospendere Jagged1 in 130 microlitri terreno di coltura / cm 2 e si applicano alle cellule in coltura.
- Incubare le cellule con perline a 37 ° C e 5% CO 2 per il periodo desiderato. Rimuovere perline con diversi lavaggi di PBS o terreno di coltura.
- Verifica attivazione segnalazione Notch mediante misurazione del bersaglio Notch trascritti genici 10.
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Representative Results
Lo scopo di questo metodo è quello della cultura e stimolare segnale di Notch in precursori degli osteoclasti. Se correttamente colto, precursori degli osteoclasti presentano una morfologia a forma di fuso principalmente allungata con citoplasma liscia (Figura 1A). Si deve prestare attenzione per evitare l'attivazione immunologica dei precursori degli osteoclasti. Dopo l'attivazione, precursori diffondono e diventano appiattito con schiuma citoplasma (Figura 1B). Queste cellule "uovo fritto" sono resistenti alla segnalazione RANK e non differenziano in modo efficiente in osteoclasti maturi. In condizioni di coltura e differenziazione corretta, precursori degli osteoclasti arricchiti si differenziano e si fondono in grandi osteoclasti multinucleate TRAP-positivi nell'arco di tre giorni (Figura 1C).
Semina precursori degli osteoclasti sul Jagged1-Fc superfici rivestite up-regola Notch geni bersaglio entro 24 ore(Figura 2). geni specifici up-regolati da Notch variano a seconda del tipo di cellula. Nel caso dei precursori degli osteoclasti, il gene più predominante up-regolati da Jagged1 è HES1, anche se Hey2 e Myc sono moderatamente up-regolato, pure. Espressione di altri geni bersaglio Notch quali Hey1 e p21 non risultano significativamente modificati dalla stimolazione Jagged1 dei precursori degli osteoclasti.
Quando precursori degli osteoclasti sono coltivate in piastre da 24 pozzetti, il trattamento con perline rivestite con un minimo di 600 ng Jagged1-Fc dimostrano un significativo aumento dell'espressione HES1 entro 24 ore (Figura 3). Quarantotto h trattamenti mostrano un aumento simile espressione HES1, anche se in misura minore.
Figura 1: cultura e differenziazione dei precursori degli osteoclasti. (A)precursori degli osteoclasti ingenui coltivate con 35 ng / ml MCSF e senza stimoli di attivazione hanno un liscio, la morfologia a forma di fuso. Barra di scala = 25 micron. (B) Dopo l'attivazione immunologica, precursori degli osteoclasti adottare un appiattito, morfologia riempito di gomma piuma e non differenziarsi in osteoclasti. Per indurre l'attivazione, precursori degli osteoclasti sono stati trattati con 10 ng / ml lipopolisaccaride per 16 ore. Barra di scala = 25 micron. (C) immunologicamente naive precursori degli osteoclasti aderenti coltivate con 35 ng / ml MCSF e 100 ng / ml per 3 giorni si differenziano in osteoclasti maturi. osteoclasti maturi sono grandi, multinucleare, e TRAP-positivo. Barra di scala = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: up-regolazione di geni bersaglio Notch in precursori degli osteoclasti placcato su immobilizzato Jagged1-Fc. precursori degli osteoclasti sono stati piastrati su immobilizzato Jagged1-Fc e coltivate per 24 ore. Durante il periodo di coltura, espressione HES1, Hey2, e Myc mRNA è stato aumentato. Altri geni bersaglio Notch, Hey1 e p21 non è stata modificata. Le barre di errore sono errori standard della media, l'importanza è stata valutata utilizzando il test t 1-coda dello studente. *, P <0,05. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: up-regolazione di HES1 mRNA in precursori degli osteoclasti trattati con perline Jagged1-Fc. 600 ng Jagged-Fc legato a proteine G agarosio up-regola l'espressione HES1 in precursori degli osteoclasti colta nel pozzo di una piastra da 24 pozzettientro le 24 ore di esposizione. HES1 induzione Jagged1-perline era paragonabile ai livelli HES1 indotti da placche Jagged1-Fc-rivestite. Altri geni bersaglio Notch che non sono stati fortemente indotte da piastre Jagged1-Fc-rivestite, non sono stati valutati. Le barre di errore sono errori standard della media, l'importanza è stata valutata utilizzando il test t 1-coda dello studente. *, P <0,05. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici all'interno del protocollo
Cultura e nella differenziazione in vitro dei precursori degli osteoclasti fornisce una piattaforma utile per l'indagine dei meccanismi molecolari di osteoclastogenesi e l'identificazione di bersagli terapeutici per la rigenerazione ossea e la conservazione della massa ossea. Quando la coltura precursori degli osteoclasti del mouse, l'elemento più critico è la manutenzione dei precursori in uno stato ingenuo. Come macrofagi-like, precursori degli osteoclasti sono pronti a rispondere alle componenti batteriche e citochine pro-infiammatorie. Dopo l'attivazione, precursori degli osteoclasti non saranno più efficiente differenziarsi in osteoclasti. La causa primaria di attivazione precursore è presenza di citochine infiammatorie come TNF o complementare impropriamente inattivato in siero fetale bovino. Per questo motivo, molte sieri devono essere testati per la loro capacità di supportare osteoclastogenesis prima dell'uso in esperimenti. Inoltre, tutti i sieri utilizzati in osteocultima la cultura deve essere precursore di calore inattivato per denaturare complemento in grado di attivare i precursori degli osteoclasti.
Modifiche e risoluzione dei problemi
In questo metodo, Jagged1-Fc è usato per stimolare Notch segnalazione dei precursori degli osteoclasti. La fusione Fc con Jagged1 facilita sia l'immobilizzazione su superfici di coltura con anticorpi anti-Fc e giunto alla proteina G perline. Altri ligandi Notch fusi a Fc, come Delta-Mi piace1-Fc, possono essere utilizzati in modo simile. Va notato che non tutti i fornitori forniscano dichiarazioni di ricombinante dell'attività Notch ligando. Pertanto, mentre leganti Notch ricombinanti possono essere ottenuti da più fornitori, occorre prestare attenzione per ottenere informazioni dell'attività biologica dal fornitore o prove di ligandi a noti cellule ligando-reattiva Notch deve essere eseguita.
Utilizzando i protocolli descritti in questo metodo consente la stimolazione costitutiva e temporanea di segno Notchaling in precursori degli osteoclasti in coltura. Il metodo standard per la rilevazione attivazione del segnale di Notch è la quantificazione dei geni bersaglio Notch tramite trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR). geni bersaglio upregulated da Notch variano da cellule, in modo che quando la stimolazione Notch viene eseguita su un tipo di cellula in precedenza uncharacterized, espressione di un pannello di canonici geni bersaglio Notch, come membri della Hes e Hey famiglia di fattori di trascrizione devono essere determinati. In un lasso di tempo più breve, l'attivazione di Notch può potenzialmente essere rilevato tramite la valutazione Western Blot di Notch intracellulare Domain (NiCd). Si deve prestare attenzione, tuttavia, come ci sono quattro recettori Notch e NiCd dai diversi recettori in diversi tipi di cellule non vengono rilasciati con la stessa intensità dopo stimolazione ligando. livello NICD nelle cellule Notch stimolate dovrebbe essere paragonato a livelli in cellule non stimolate per tenere conto per il rilascio della linea di base NiCd.
Limitazioni della tecnica Anche se questo metodo è teoricamente applicabile a tutti i ligandi Notch, fino ad oggi è stato solo applicati in modo coerente con Jagged1 e Delta-Mi piace1 10, 20, 21. Ulteriori test saranno necessari per determinare se altri ligandi Notch sono suscettibili a questo metodo. Questo metodo è anche aspecifico nel suo recettore Notch; valutazione della specifica attivazione del recettore Notch dopo stimolazione con questo metodo è necessario attribuire risposte cellulari a particolari recettori Notch.
Importanza della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi
differenziazione degli osteoclasti è dipendente su entrambi i osteoclasti numero precursore e osteoclasti precursore potenziale di differenziazione. La valutazione di osteoclasti differenziazione delle popolazioni del midollo osseo misti non può distinguere tra alterazioni degli osteoclasti precursor numero e la cella potenziale di differenziazione autonomo. Arricchimento dei precursori degli osteoclasti prima ai controlli di differenziazione per le differenze riguardanti i numeri di precursori e permette una più stretta interrogatori del processo di differenziazione degli osteoclasti. Dato che Notch esercita effetti diversi in diversi punti durante osteoclastogenesis, il controllo temporale del segnale di Notch sia e la differenziazione degli osteoclasti sono essenziali per una corretta indagine dei meccanismi molecolari che governa.
Le future applicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Usando questo protocollo, la valutazione dei ruoli per la segnalazione Notch può essere effettuata non solo in precursori degli osteoclasti, ma potenzialmente in altri tipi di cellule, come bene. Variando la lunghezza della stimolazione e del tempo di apertura di Notch Notch, potenziali ruoli multi-fasica di Notch in una varietà di processo cellulare può essere definito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
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