אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
מנועי flagellar לאפשר תאים לשחות ידי החלפת חוטים תאיים סליל. כמות מומנט המנוע יכול לייצר עבור באורך נתון של השוטון (כלומר, את העומס הצמיג) מקובעת את מהירויות השחייה. מצד השני, היכולת שלה כדי להעביר את כיוון הסיבוב שולטת נדידת תאים בתגובת כימיקלים, תהליך המכונה chemotaxis. Chemotaxis ו ארסיות להיות תנועתיות גורמי 1-3, מנועים flagellar מתאפיינים היטב במשך השנים 4. הראיות המצטברות החברה עולה כי המנוע משמש mechanosensor – זה מכנית מזהה נוכחות של 5,6 מצעים מוצקים. יכולת זו מסייעת סביר המעוררים קולוניזציה משטח וזיהומים 5,7. כתוצאה מכך, המנגנונים לפיה מנוע חושי משטחים ויוזם איתות הם בעלי חשיבות 8,9.
מנוע flagellar ניתן ללמוד בקלות על ידי קושר את flagellאממ לרוטצית תא מצע והתבוננות. קשירה כזו הושגה לראשונה על ידי סילברמן וסיימון, שעבד עם מוטציה polyhook ב E. coli ו ווים לחבר בהצלחה מצעי זכוכית עם נוגדנים נגד וו 10. את assay הקשורים התאים אפשר לחוקרים ללמוד את התגובות של מתג המנוע למגוון של גירויים כימיים. לדוגמה, סגל ועמיתים לעבודה מגורה תאים קשור כימית בעזרת טפטפות iontophoretic. השינויים המתאימים הטיה CW (את החלק היחסי של מנועים הזמן לסובב עם כיוון השעון, CW) אפשרה להם למדוד את קינטיקה של הסתגלות ברשת chemotaxis 11,12. בעוד assay התא הקשור היה יעיל בחן את תשובות מתג, זה היה מסוגל רק להציע תובנה מכניקת מנוע פני טווח מוגבל של עומסים צמיגים 13. כדי להתגבר על בעיה זו, ריו ועמיתים לעבודה קשורה כדורי, חרוזי גומי כדי נימה השוברים על תאים תקועים על משטחים. החרוזים היואז מעקב באמצעות אינטרפרומטריה גב מוקד עם מלכודות אופטיות חלשות 14. הודות לשיתוף פעולה עם חרוזים בגדלים שונים, חוקרים יכלו ללמוד את המנוע על פני טווח רחב יותר של עומסים. assay זה היה שיפור מאוחר יותר על ידי יואן וברג, אשר פיתח טכניקה חרוז מעקב מבוססי מכפיל בשילוב עם תאורה כהה שדה לייזר. המעקב מופעל שיטתם של nanobeads זהב הקשור כי הם כה זעירים (~ 60 ננומטר) כי ההתנגדויות הצמיגות החיצוניות היו נמוכות לעומת ההתנגדויות הצמיגות הפנימיות סיבוב 15,16. זה הוביל את המידות של מהירויות המרביות השגה ב E. coli (~ 300 הרץ). ב V. alginolyticus, מבחני חרוז דומים מופעלים מדידות של שיעורי ספינינג בעומסים צמיגים ביניים (~ 700 הרץ) 17. בכך שהיא מאפשרת מדידות של תגובות המנוע על פני הטווח האפשרי השלם של המון צמיגה (מאפס עומס לקרוב-דוכן), החרוז-המבחנים ספקו כלי biophysical חשוב להבין את torque דור תהליך 18,19.
לאחרונה, שינינו את assay יואן-ברג לכלול פינצטה אופטית שאפשרה לנו ליישם גירויים מכאניים מדויקים מנועים בודדים 6. באמצעות טכניקה זו, הראינו כי-גנרטורים כוח לסובב את המנוע הם mechanosensors דינמי – יעשו שינויים בתגובה לשינויים המון צמיגה. יתכן כי עומס חישה כגון מפעילת התמיינות תאים לתוך חיידקים שורצים, למרות המנגנונים עדיין אינם ברורים. כמו כן סביר להניח כי מנועי flagellar במינים אחרים הם גם mechanosensitive 20, למרות ראיות ישירות חסרות. כאן, אנו דנים מבוססי מכפיל (PMT) הגישה למעקב אחר סיבוב של חרוזים לטקס הרתומים חוטים flagellar 15. בהשוואת מעקב עם מצלמות מהירות, את ההתקנה המכפילה יש יתרון משום שהוא הוא פשוט יחסית כדי לעקוב אחר חרוזים יחידים בזמן אמת ושוב הדורה ארוכהמשא. זה שימושי במיוחד כאשר לומדים ותיק שיפוץ מתחמי מנוע flagellar בשל גירויים סביבתיים 21. למרות שאנחנו פרוטוקולים בפירוט במיוחד עבור E. coli, הם יכולים להתאים בקלות ללימוד מנועים flagellar במינים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת להקל על מעקב חרוז קשור ואמידה נכונה של מגבילי מנוע, את המידע הבא צריך להיבדק. בעת ביצוע מדידות אלה עם תאים והולקה בשוט, הגז הוא שלב קריטי. גזיזה מפחיתה את נימת flagellar כדי בדל גרידא, ובכך להבטיח כי העומס הצמיג על המנוע הוא בעיקר בשל החרוז ניתן לאמוד בתוך 10% שגיאה 16…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
