توصيف الفيزيائية الحيوية من وظائف سوطي للسيارات
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
المحركات سوطي تمكن خلايا السباحة عن طريق تناوب خيوط الخلية حلزونية. كمية من عزم الدوران المحرك يمكن أن تولد لمدة معينة من السوط (أي الحمل لزج) يحدد سرعة السباحة. من ناحية أخرى، قدرته على تبديل اتجاه دوران تسيطر هجرة الخلايا في الاستجابة للمواد الكيميائية، وهي عملية تعرف باسم الكيميائي. الكيميائي والحركة كونها عوامل الفوعة 1-3، والمحركات سوطي تم التعرف بشكل جيد على مدى 4 سنوات. وتشير أدلة متزايدة الآن أن المحرك بمثابة mechanosensor – يكشف ميكانيكيا وجود ركائز متينة 5،6. هذه القدرة على الأرجح يساعد في إحداث الاستعمار السطحية والالتهابات 5،7. ونتيجة لذلك، فإن الآليات التي تستشعر المحرك الأسطح ويبادر إشارات ذات مغزى 8،9.
المحرك سوطي يمكن دراستها بسهولة عن طريق الربط في flagellأم إلى الركيزة ومراقبة دوران الخلية. وقد تحقق هذا الربط لأول مرة من قبل سيلفرمان وسيمون، الذي عمل مع متحولة polyhook في كولاي والسنانير تعلق بنجاح إلى ركائز الزجاج مع أضداد هوك 10. تمكين فحص خلايا المربوطة الباحثين لدراسة ردود المحرك التحول إلى مجموعة متنوعة من المحفزات الكيميائية. على سبيل المثال، سيغال وزملاء العمل حفز كيميائيا الخلايا المربوطة مع المعونة من الماصات iontophoretic. التغييرات المقابلة في التحيز CW (جزء من المحركات الوقت تدور في اتجاه عقارب الساعة، CW) مكنهم من قياس حركية التكيف في شبكة الكيميائي 11،12. في حين كان فحص الخلايا المربوطة فعال في دراسة ردود التبديل، وكان قادرا على تقديم نظرة ثاقبة ميكانيكا السيارات على نطاق محدود من الأحمال لزجة 13 فقط. للتغلب على هذه المشكلة، المربوطة ريو وزملاء العمل كروية، والخرز اللاتكس لخيوط بذرة على خلايا تمسك السطوح. وكانت حباتثم تتبعها باستخدام التداخل العودة التنسيق مع ضعف الفخاخ البصرية 14. من خلال العمل مع حبات من مختلف الأحجام، يمكن للباحثين دراسة المحرك على نطاق أوسع بكثير من الأحمال. تم تحسين هذا الاختبار في وقت لاحق من قبل يوان وبيرغ، الذي طور تقنية حبة تتبع القائم على مضخم جنبا إلى جنب مع إضاءة الليزر الظلام الميدان. طريقتهم تتبع تمكين من nanobeads المربوطة الذهب التي كانت صغيرة جدا (~ 60 نانومتر) أن المقاومة لزجة الخارجية كانت أقل مقارنة مع المقاومة لزجة الداخلية للتناوب 15،16. وأدى ذلك إلى قياسات أقصى سرعة للتحقيق في كولاي (~ 300 هرتز). في الخامس alginolyticus، المقايسات حبة مماثلة مكنت قياسات لمعدلات الغزل في الأحمال المتوسطة لزجة (~ 700 هرتز) 17. من خلال تمكين قياس الاستجابات الحركية على مجموعة كاملة ممكن من الأحمال لزجة (من صفر-تحميل لشبه كشك)، قدمت المقايسات حبة أداة الفيزيائية الحيوية الهامة لفهم رعملية توليد orque-18،19.
في الآونة الأخيرة، فإننا تعديل فحص يوان بيرغ لتشمل ملاقط البصرية التي مكنتنا من تطبيق مؤثرات الميكانيكية الدقيقة لمحركات الفردية 6. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن مولدات القوة التي تدوير المحرك هي mechanosensors ديناميكية – أنها إعادة تشكيلها في استجابة للتغيرات في الأحمال لزجة. فمن الممكن أن هذا استشعار الحمل يؤدي إلى تمايز الخلايا البكتيريا يحتشدون، على الرغم من أن الآليات لا تزال غير واضحة. ومن المرجح أيضا أن المحركات سوطي في الأنواع الأخرى هي أيضا mechanosensitive 20، على الرغم من الأدلة المباشرة غير موجودة. هنا، نحن نناقش النهج القائم على مضخم (PMT) لتتبع دوران من الخرز اللاتكس المربوطة إلى خيوط سوطي 15. بالمقارنة مع تتبع مع الكاميرات فائق السرعة، ومضخم-الإعداد هو مفيد لأنه واضح ومباشر نسبيا لتعقب الخرز واحد في الوقت الحقيقي، وأكثر من الجافية طويلةستعقد. وهي مفيدة بشكل خاص عند دراسة طويلة وقت إعادة عرض في المجمعات المحرك سوطي بسبب المحفزات البيئية 21. على الرغم من أننا بروتوكولات التفاصيل خصيصا لكولاي، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة المحركات سوطي في الأنواع الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل تسهيل المربوطة حبة تتبع وتقدير الصحيح من المحركات عزم الدوران، يجب مراجعة المعلومات التالية. عند إجراء هذه القياسات مع خلايا سوطي، والقص هو خطوة حاسمة. قص يقلل من خيوط سوطي إلى مجرد كعب، وبالتالي ضمان أن يكون الحمل لزج على المحرك يرجع في الغالب إلى حبة ويمكن تق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
References
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
