Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
Flagellenmotoren ermöglichen Zellen durch Drehen Schraubenextrazellulären Filamente zu schwimmen. Der Betrag des Drehmoments des Motors für eine gegebene Länge des Flagellums erzeugen kann (dh die viskose Last) bestimmt die Schwimmgeschwindigkeit. Auf der anderen Seite, seine Fähigkeit, die Drehrichtung steuert, die Zellmigration in Reaktion auf Chemikalien, ein Verfahren bekannt, wie Chemotaxis zu wechseln. Chemotaxis und Beweglichkeit sind Virulenzfaktoren 1-3, Flagellenmotoren wurden 4 über die Jahre gut charakterisierte. Montage Hinweise darauf , nun , dass der Motor als Mechanosensor wirkt – es erkennt , mechanisch das Vorhandensein von festen Substraten 5,6. Diese Fähigkeit hilft wahrscheinlich bei der Auslösung von Oberflächenbesiedlung und Infektionen 5,7. Als Ergebnis, wobei die Mechanismen die Motoroberflächen und initiiert Signalisierungs Sinne sind von Bedeutung 8,9.
Der Flagellenmotors kann leicht durch Anbinden der flagell untersucht werdenum auf ein Substrat und das Beobachten Zellrotation. Solche Anbinden wurde zuerst von Silverman und Simon erreicht, der mit einer polyhook Mutante in E. coli und erfolgreich befestigt Haken auf Glassubstrate mit anti-hook Antikörper 10 gearbeitet. Die tethered-Zell-Assay Forschern ermöglicht, die Antworten des Motorschalter in einer Vielzahl von chemischen Stimuli zu studieren. Zum Beispiel Segall et al chemisch gebundenen Zellen mit Hilfe von iontophoretischen Pipetten stimuliert. Die entsprechenden Änderungen in CW bias (der Bruchteil der Zeit Motoren drehen im Uhrzeigersinn CW) ermöglichte es ihnen 11,12 die Kinetik der Anpassung in der Chemotaxis – Netzwerk zu messen. Während die tethered – Zell – Assay in Studium Schalter Reaktionen wirksam war, war es nur in der Lage Einblicke in Motormechanik 13 über einen begrenzten Bereich von viskosen Belastungen zu bieten. Um dieses Problem zu überwinden, Ryu et al gebunden sphärisch, Latexperlen stubs auf Zellen an Oberflächen geklebt Filaments. Die Perlen wurdendann zurückverfolgt Brenn Interferometrie mit schwachen optischen Fallen 14 verwendet wird . Durch die Arbeit mit Perlen unterschiedlicher Größe, könnten Forscher untersuchen den Motor über eine viel breitere Palette von Lasten. Dieser Assay wurde später verbessert durch Yuan und Berg, der einen Photovervielfacher-basierte bead-Verfolgungstechnik mit Laser-Dunkelfeldbeleuchtung in Kombination entwickelt. Ihre Methode ermöglicht Verfolgung von tethered Gold Nanobeads , die so klein waren (~ 60 nm) , dass die externen viskoser Widerstände waren niedriger im Vergleich zu den inneren viskosen Widerstände gegen Rotation 15,16. Dies führte zu den Messungen der maximal erreichbaren Geschwindigkeiten in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, ähnlich Perle Assays Messungen der Spinngeschwindigkeiten bei Zwischen viskos Lasten (~ 700 Hz) 17 aktiviert. Durch die Aktivierung Messungen der motorischen Reaktionen über den gesamten möglichen Bereich von viskosen Lasten (von Null-Last bis nahen Stall), vorausgesetzt, die Wulst-Assays ein wichtiges Werkzeug, um die biophysikalischen t zu verstehen,orque-Erzeugungsprozess 18,19.
Vor kurzem geändert wir den Yuan-Berg – Test optische Pinzette aufzunehmen , die uns präzise mechanische Reize auf einzelne Motoren 6 anwenden aktiviert. Unter Verwendung dieser Technik haben wir gezeigt, daß die Kraftgeneratoren, die den Motor dynamisch sind Mechanosensoren drehen – sie remodellieren in Reaktion auf Änderungen in viskoser Lasten. Es ist möglich, dass solche Load-Sensing-Zelldifferenzierung in Schwärmen Bakterien ausgelöst wird, obwohl die Mechanismen unklar bleiben. Sie ist auch wahrscheinlich , dass die Flagellenmotoren in anderen Spezies sind auch mechanosensitive 20, direkte Beweise fehlen. Hier diskutieren wir die Photomultiplier-basierte (PMT) Ansatz zur Verfolgung der Rotation von Latex – Kügelchen gebunden an Flagellen Fäden 15. Im Vergleich mit ultraschnellen Kameras Verfolgung der Photomultiplier-Aufbau ist vorteilhaft, da es relativ einfach ist, einzelne Perlen in Echtzeit und über lange dura zu verfolgengen. Es ist besonders nützlich , wenn 21 Umbau in Flagellenmotors Komplexe durch Umweltreize seit langer Zeit zu studieren. Obwohl wir Detail Protokolle speziell für E. coli, können sie leicht für das Studium Flagellenmotoren in anderen Arten angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um tethered Wulst-Tracking und korrekte Schätzung der Motor-Drehmomente zu erleichtern, sollten die folgenden Informationen überprüft werden. Wenn diese Messungen mit flagellated Zellen durchgeführt wird, Scherung ist ein kritischer Schritt. Shearing reduziert die Flagellenfilamenten auf eine bloße stub, wodurch sichergestellt wird, dass die viskose Last auf dem Motor zu dem Wulst überwiegend aus und kann innerhalb von 10% Fehler 16 geschätzt werden. Shearing verbessert auch die Chancen mit dicht verte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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