Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Flagellpol motorer gjør at cellene til å svømme ved å rotere spiral ekstracellulære filamenter. Mengden av dreiemomentet på motoren kan generere for en gitt lengde av flagellen (dvs. den viskøse belastning) bestemmer svømmehastigheter. På den annen side dets evne til å veksle rotasjonsretningen kontrollerer cellemigrering som reaksjon på kjemikalier, en prosess som kalles kjemotaksis. Chemotaxis og motilitet være virulens faktorer 1-3, flagellpol motorer har blitt godt karakterisert gjennom årene 4. Monterings bevis tyder nå på at motoren virker som en mechanosensor – det mekanisk detekterer tilstedeværelsen av faste substrater 5,6. Denne evnen sannsynlig hjelper i å utløse overflaten kolonisering og infeksjoner 5,7. Som et resultat av mekanismene hvorved motoren sanser overflater og initierer signalisering er av betydning 8,9.
Den flagell Motoren kan lett undersøkes ved forankring av de flagellum på et substrat og å observere celle rotasjon. En slik deling ble først oppnådd ved Silverman og Simon, som jobbet med en polyhook mutant i E. coli og vellykket festet kroker til glass underlag med anti-krok antistoffer 10. Den forankrede-celleanalyse aktivert forskere for å studere reaksjoner fra motorbryteren til en rekke kjemiske stimuli. For eksempel, Segall og medarbeidere kjemisk stimulert tethered celler ved hjelp av iontoforetiske pipetter. De tilsvarende endringer i CW skjevhet (brøkdel av tiden motorer snurrer med klokken, CW) gjorde dem i stand til å måle kinetikken av tilpasning i kjemotaksien nettverket 11,12. Mens tethered celle analysen var effektiv i å studere bryter svar, var det bare i stand til å tilby innsikt i bilmekanikere over et begrenset utvalg av tyktflytende masse 13. For å løse dette problemet, Ryu og medarbeidere tjoret sfæriske, latex perler til filament stubber på celler stakk til overflater. Perlene varderetter spores ved hjelp av back-focal interferometri med svake optiske feller 14. Ved å arbeide med perler av forskjellige størrelser, kan forskere studere motor over et mye bredere område av belastninger. Denne analysen ble senere forbedret ved Yuan og Berg, som utviklet en photomultiplier basert perle-sporing teknikk kombinert med laser mørke-feltet belysning. Deres metode aktivert sporing av tethered gull nanobeads som var så liten (~ 60 nm) at de eksterne viskøse motstander var lavere i forhold til de interne viskøse motstand til rotasjon 15,16. Dette førte til at målinger av maksimalt oppnåelige hastigheter i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, tilsvar perle analyser aktivert målinger av spinning priser på innsats viskøse laster (~ 700 Hz) 17. Ved å muliggjøre målinger av motorresponser over hele mulige området av viskøse laster (fra null belastning til nær-stall), bead-analysene gitt en viktig biofysisk verktøy for å forstå torque generasjon prosessen 18,19.
Nylig endret vi Yuan-Berg analysen å inkludere optiske pinsetter som gjorde oss i stand til å anvende presise mekaniske stimuli til individuelle motorer 6. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi at kraftgeneratorer som roterer motoren er dynamiske mechanosensors – de fornye som reaksjon på endringer i viskøse laster. Det er mulig at en slik lastfølende utløser celledifferensiering i svermende bakterier, selv om mekanismene uklare. Det er også sannsynlig at flagellpol motorer i andre arter er også mechanosensitive 20, selv om direkte bevis mangler. Her diskuterer vi photomultiplier-baserte (PMT) tilnærming for å spore rotasjon av latexkuler tjoret til flagellpol filamenter 15. I forhold til sporing med lynraske kameraer, er det photomultiplier-setup en fordel fordi det er relativt enkelt å spore enkelt perler i sanntid og over lang durasjoner. Det er spesielt nyttig når man studerer lang tid ombygging i flagellpol motor komplekser på grunn av miljømessige stimuli 21. Selv om vi detaljerte protokoller spesielt for E. coli, kan de lett tilpasses for å studere flagellære motorer i andre arter.
For å lette tethered perle-sporing og korrekt estimering av motor-dreiemomenter, bør følgende informasjon gjennomgås. Når du utfører disse målingene med flagellerte celler, er klipping et kritisk punkt. Shearing reduserer flagell filamentet til en mer stump, for derved å sikre at den viskøse belastningen på motoren er hovedsakelig på grunn av vulsten og kan estimeres innenfor 10% feil 16. Shearing forbedrer også sjansene for å finne sirkulære baner med tett fordelte eksentriske (<perle diamet…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |