Summary

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Published: May 24, 2017
doi:

Summary

Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.

Abstract

Sapere come i RNA interagiscono con se stessi e con gli altri è fondamentale per capire la regolazione del gene basato su RNA nella cellula. Mentre esempi di interazioni RNA-RNA come le interazioni di microRNA-mRNA sono state dimostrate per regolare l'espressione genica, l'intero grado in cui si verificano interazioni RNA nella cella è ancora sconosciuto. I metodi precedenti per studiare le interazioni di RNA si sono concentrati principalmente su subsets di RNA che interagiscono con una particolare proteina o specie di RNA. Qui, abbiamo dettagliato un metodo denominato S equencing di P soralen crosslinked, L igated, e S eletti H ybrids (SPLASH) che consente la cattura genoma di interazioni RNA in vivo in modo imparziale. SPLASH utilizza la reticolazione in vivo , la legatura di prossimità e il sequenziamento ad alta velocità per identificare partner globalmente associati alla base di RNA intramolecolare e intermolecolare. SPLASH può essere applicato a diversi organismi, compresi batteri, lieviti e cellule umane, nonché aS diverse condizioni cellulari per facilitare la comprensione della dinamica dell'organizzazione di RNA in diversi contesti cellulari. L'intero protocollo sperimentale SPLASH richiede circa 5 giorni per completare e il flusso di lavoro computazionale richiede circa 7 giorni per completare.

Introduction

Studiare come macromolecole si piegano e interagiscono tra loro è la chiave per comprendere la regolazione del gene nella cellula. Mentre molti sforzi sono stati focalizzati nell'ultimo decennio per comprendere come il DNA e le proteine ​​contribuiscono alla regolazione del gene, è relativamente meno noto circa la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. L'RNA trasporta informazioni sia nella sequenza lineare che nella struttura secondaria e terziaria 1 . La sua capacità di fondare la coppia con se stessa e con gli altri è importante per la sua funzione in vivo . I progressi recenti nel sondaggio della struttura secondaria RNA a elevata produttività hanno fornito preziosi approfondimenti sulle posizioni delle regioni a doppia e singola banda nel transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer le informazioni sui partner di interazione di coppia sono ancora in gran parte mancanti. Per determinare quale sequenza RNA interagisce con un'altra regione RNA nel trascrittoma, abbiamo bisogno di informazioni globali a livello di coppia.

La mappatura delle interazioni RNA in coppia in maniera globale e imparziale è stata tradizionalmente una grande sfida. Mentre gli approcci precedenti, come CLASH 9 , hiCLIP 10 e RAP 11 , vengono utilizzati per identificare le interazioni RNA in modo scalare, queste tecniche tipicamente mappano l'accoppiamento base di RNA per un sottoinsieme di RNA che interagiscono con una particolare specie di proteine ​​o RNA. Gli sviluppi recenti nello studio delle interazioni globali di RNA includono il metodo RPL 12 , che non stabilizza le interazioni RNA in vivo e quindi può solo catturare un sottoinsieme di interazioni in vivo . Per superare queste sfide, noi e gli altri abbiamo sviluppato strategie prive di genoma e maestoseP interazioni di RNA in vivo , utilizzando versioni modificate del psoralen 13 , 14 , 15 del reticolatore. In questo protocollo, descriviamo i dettagli per eseguire l'equilibrio di S di P soralen incrociato, L igato e S eligibriti (SPLASH), che utilizza il psoralene biotinilato in RNA in accoppiamento a base di collegamento in vivo in seguito alla legatura di prossimità e ad alta sequenza di throughput a Individuare i partner RNA base-pairing in tutto il genoma ( Figura 1 ) 15 .

In questo manoscritto descriviamo i passaggi per eseguire SPLASH utilizzando cellule aderenti colte, in questo caso le cellule HeLa. Lo stesso protocollo può essere facilmente adattato alle cellule di mammiferi di sospensione e alle cellule di lievito e batteri. In breve, le cellule HeLa vengono trattate con psoralene biotinilato e irradiati a 365 nm per incrociare in coppia le coppie di RNA interattive in vivo. I RNA vengono quindi estratti dalle cellule, frammentati e arricchiti per le regioni di reticolazione usando perline di streptavidina. I frammenti RNA interattivi vengono quindi legati insieme usando la legatura di prossimità e fatti in una libreria di cDNA per la sequenza profonda. Al sequenziamento, gli RNA chimerici vengono mappati sul transcriptome / genoma per identificare le regioni interagenti RNA che sono accoppiate tra loro. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH per identificare migliaia di interazioni RNA in vivo in lieviti e diverse cellule umane, tra cui l'accoppiamento base di RNA intramolecolare e intermolecolare in diverse classi di RNA, come snoRNA, lncRNA e mRNA, per intravedere nell'organizzazione strutturale e nei modelli di interazione Di RNA nella cella.

Protocol

1. Trattamento delle cellule HeLa con estrazione di Psoralen e RNA biotinilata Coltivano le cellule HeLa nel mezzo di Eagle di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina streptomicina (PS) in una piastra di 10 cm. Lavare le cellule HeLa due volte con 5 ml di 1x PBS. Scaricare completamente il PBS dal piatto posando il piatto verticalmente per 1 minuto. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 200 μM di psoralene biotinilato e 0,01% w / v digitonin, alle ce…

Representative Results

La figura 1 rappresenta lo schema del flusso di lavoro SPLASH. Dopo l'aggiunta di psoralene biotinilato in presenza di 0,01% di digitonina e di reticolazione UV, viene estratto un totale di RNA dalle cellule e viene eseguita una macchia di punti per assicurare che il collegamento a biotinilato con l'RNA sia accaduto in modo efficace ( Figura 2 ). Utilizziamo oligosini biotinilati 20 come controlli positivi per titolare l…

Discussion

Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro sperimentale e computazionale per SPLASH, un metodo che ci permette di identificare le interazioni RNA a due mani in modo genico-wide. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH nelle colture batteriche, lieviti e umane e anticipo che la strategia possa essere ampiamente applicata a organismi diversi in diversi stati cellulari. Uno dei passaggi critici del protocollo è quello di iniziare con almeno 20 μg di RNA reticolato per avere materiale adeguato per i processi a valle….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri del laboratorio di Wan e il laboratorio di Nagarajan per le discussioni informative. N.Nagarajan è supportato da finanziamenti da A * STAR. Y.Wan è sostenuto da finanziamenti da A * STAR e dalla Società in borsa Science-Branco Weiss.

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10787026 DNA ladder
10 bp DNA ladder Life Technologies Holdings Pte Ltd 10821-015 DNA ladder
20 % SDS solution First BASE BUF-2052-1L  
20x SSC First BASE BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution First BASE BUF-1151-1L-pH5.2   Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio-Rad 1610145 TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit Life Technologies Holdings Pte Ltd AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade   Promega V3131  TBE Urea gel component
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Chloroform Merck 1.02445.1000 RNA extraction
Single strand DNA ligase Epicentre CL9025K CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters Sigma-Aldrich CLS8160-96EA Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE Sigma-Aldrich D5628-1G For cell treatment
Dark Reader Transilluminator  Clare Chemical Research Dark Reader DR89X Transilluminator Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X) Life Technologies Holdings Pte Ltd R0611 Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan BioTech P04-03500 For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads Life Technologies Holdings Pte Ltd 65002 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15ml tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd 12301D DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes Life Technologies Holdings Pte Ltd  12321D DynaMag-2
ThermoMixer Eppendorf 5382 000.015 Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen Life Technologies Holdings Pte Ltd 29986 EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL  Hitachi F8T5/BL  365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum Life Technologies Holdings Pte Ltd 10270106   Components of Hela medium
Formamide Promega H5052   Component in hybridization buffer
G8T5 Sankyo-Denki G8T5 254 nm UV bulb
Glycogen  Life Technologies Holdings Pte Ltd 10814010 Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop Life Technologies Holdings Pte Ltd Nanodrop 2000 Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water  First BASE BUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd 15140122   Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x) Life Technologies Holdings Pte Ltd F531L  Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1 New England Biolabs E7335L  PCR primers
DNA Gel Extraction Kit QIAgen 28106 QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit Life Technologies Holdings Pte Ltd Q32854 Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit Qiagen 74106 RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor Life Technologies Holdings Pte Ltd AM2696 SUPERase In
Reverse transcriptase Life Technologies Holdings Pte Ltd 18080400 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies Holdings Pte Ltd S11494 SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs M0204L Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ New England Biolabs M0373L Enzyme for adaptor ligation
Temed Bio-Rad 1610801 TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Life Technologies Holdings Pte Ltd 15596018 TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea First BASE BIO-2070-5kg  
UV crosslinker Stratagene 400072 UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator UVP 95-0417-01 For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich X4126-10G
DNA cleanup it Zymo Research  D4004 Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software 0.11.4 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software 1.0.7 https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software 0.7.12 http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software 1.2.1 http://www.htslib.org/
PULLSEQ software 1.0.2 https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software 2.5.0c https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script PYTHON 2.7.11 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script AWK GNU 4.1.2 https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer: 
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA 
3' RNA adapter sequence 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
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  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
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check_url/55255?article_type=t

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Cite This Article
Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).

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