Her spesifiserer vi metoden for S- ekventering av P- sor-nen, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), som muliggjør genomfattende kartlegging av intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaksjoner in vivo . SPLASH kan brukes til å studere RNA-interaktomer av organismer, inkludert gjær, bakterier og mennesker.
Å vite hvordan RNAer interagerer med seg selv og med andre er nøkkelen til å forstå RNA-basert genregulering i cellen. Mens eksempler på RNA-RNA-interaksjoner, så som mikroRNA-mRNA-interaksjoner, har vist seg å regulere genuttrykk, er den totale utstrekningen av RNA-interaksjoner i cellen fortsatt ukjent. Tidligere metoder for å studere RNA-interaksjoner har primært fokusert på delsett av RNA som interagerer med et bestemt protein eller RNA-art. Her beskriver vi en metode som heter S- ekventering av P soralen, som er kryssbundet, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH) som tillater genomsøking av RNA-interaksjoner in vivo på en upartisk måte. SPLASH benytter in vivo tverrbinding, nærliggende ligering og høy gjennomstrømningssekvensering for å identifisere intramolekylære og intermolekylære RNA-baseparingspartnere globalt. SPLASH kan brukes på forskjellige organismer, inkludert bakterier, gjær og humane celler, samt aS mangfoldige cellulære forhold for å lette forståelsen av dynamikken til RNA-organisasjonen under ulike cellulære sammenhenger. Hele eksperimentelle SPLASH-protokollen tar omtrent 5 dager å fullføre, og beregningsarbeidet tar omtrent 7 dager å fullføre.
Å studere hvordan makromolekyler brettes og samhandler med hverandre er nøkkelen til å forstå genregulering i cellen. Mens mye innsats har vært fokusert i det siste tiåret på å forstå hvordan DNA og proteiner bidrar til genregulering, er relativt mindre kjent om post-transkripsjonell regulering av genuttrykk. RNA bærer informasjon i både sin lineære sekvens og i sin sekundære og tertiære struktur 1 . Dens evne til å basere par med seg selv og med andre er viktig for sin funksjon in vivo . Nylige fremskritt i RNA sekundære strukturundersøkelser med høy gjennomstrømning har gitt verdifull innsikt i plasseringene av dobbelt- og enkeltstrengede regioner i transkriptom 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informasjon om parringssamarbeidspartnerne mangler fortsatt stort sett. For å avgjøre hvilken RNA-sekvens som interagerer med en annen RNA-region i transkriptomet, trenger vi global parvis informasjon.
Kartlegging av parvise RNA-interaksjoner på global, upartisk måte har tradisjonelt vært en stor utfordring. Mens tidligere tilnærminger, som for eksempel CLASH 9 , hiCLIP 10 og RAP 11 , brukes til å identifisere RNA-interaksjoner i stor skala, kartlegger disse teknikkene vanligvis RNA-baseparing for en delmengde av RNA som enten interagerer med et bestemt protein eller RNA-art. Nylige utviklinger i å studere globale RNA-interaksjoner inkluderer metoden RPL 12 , som ikke stabiliserer RNA-interaksjoner in vivo, og kan derfor bare fange en delmengde av in vivo- interaksjoner. For å overvinne disse utfordringene utviklet vi og andre genoom-brede, upartiske strategier til maP RNA-interaktomer in vivo ved bruk av modifiserte versjoner av tverrbindingspsoralen 13 , 14 , 15 . I denne protokollen beskriver vi detaljene for utførelse av S- ekventering av P- sor-nen, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), som benytter biotinylert psoralen til tverrbindingsbaseparasjons-RNAer in vivo , etterfulgt av nærliggende ligering og høy gjennomstrømningssekvensering til Identifisere RNA-baseparingspartnere genomgående ( figur 1 ) 15 .
I dette manuskriptet beskriver vi trinnene for å utføre SPLASH ved hjelp av dyrkede adherente celler, i dette tilfellet HeLa-celler. Den samme protokollen kan lett tilpasses til suspensjonspattedyrceller og til gjær- og bakterieceller. Kort fortalt behandles HeLa-celler med biotinylert psoralen og bestråles ved 365 nm for å krysse sammenvirkende RNA basepar in vivo.. RNAene ekstraheres deretter fra cellene, fragmentert og anriket for tverrbundende regioner ved bruk av streptavidinperler. Interaktive RNA-fragmenter blir deretter ligert sammen ved bruk av nærliggende ligering og gjort til et cDNA-bibliotek for dyp sekvensering. Ved sekvensering er de kimære RNAene kartlagt på transkriptomet / genomet for å identifisere RNA-interaksjonsregioner som er parret til hverandre. Vi har vellykket utnyttet SPLASH for å identifisere tusenvis av RNA-interaksjoner in vivo i gjær og forskjellige humane celler, inkludert intramolekylær og intermolekylær RNA-baseparing i forskjellige klasser av RNA, som snoRNA, lncRNA og mRNA, for å glimt inn i strukturorganisasjonen og samspillsmønstre Av RNA i cellen.
Her beskriver vi i detalj den eksperimentelle og beregningsfulle arbeidsflyten for SPLASH, en metode som gjør at vi kan identifisere parvise RNA-interaksjoner på en genom-bred måte. Vi har vellykket utnyttet SPLASH i bakterielle, gjær og menneskelige kulturer og forventer at strategien kan brukes allment til ulike organismer under forskjellige celletilstander. En av de kritiske trinnene i protokollen er å starte med minst 20 μg tverrbundet RNA for å ha tilstrekkelig materiale til nedstrøms prosesser. RNAet blir …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Wan lab og Nagarajan lab for informative diskusjoner. N.Nagarajan støttes av finansiering fra A * STAR. Y.Wan støttes av finansiering fra A * STAR og Society i Science-Branco Weiss Fellowship.
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
List of software required | |||
FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
Buffer composition | |||
Elution buffer: | |||
0.3 M sodium acetate | |||
Lysis Buffer: | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
10 mM EDTA | |||
1% SDS | |||
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
Proteinase K Buffer | |||
100 mM NaCl | |||
10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
0.5% SDS | |||
Hybridization Buffer | |||
750 mM NaCl | |||
1% SDS | |||
50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
1 mM EDTA | |||
15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
Always add Superase-in fresh before use | |||
2x SSC Wash Buffer | |||
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
0.5% SDS | |||
2X RNA fragmentation buffer | |||
18mM MgCl2 | |||
450mM KCl | |||
300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
2x RNA loading Dye: | |||
95% Formamide | |||
0.02% SDS | |||
0.02% bromophenol blue | |||
0.01% Xylene Cyanol | |||
1mM EDTA | |||
3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |