Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Summary

Her spesifiserer vi metoden for S- ekventering av P- sor-nen, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), som muliggjør genomfattende kartlegging av intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaksjoner in vivo . SPLASH kan brukes til å studere RNA-interaktomer av organismer, inkludert gjær, bakterier og mennesker.

Abstract

Å vite hvordan RNAer interagerer med seg selv og med andre er nøkkelen til å forstå RNA-basert genregulering i cellen. Mens eksempler på RNA-RNA-interaksjoner, så som mikroRNA-mRNA-interaksjoner, har vist seg å regulere genuttrykk, er den totale utstrekningen av RNA-interaksjoner i cellen fortsatt ukjent. Tidligere metoder for å studere RNA-interaksjoner har primært fokusert på delsett av RNA som interagerer med et bestemt protein eller RNA-art. Her beskriver vi en metode som heter S- ekventering av P soralen, som er kryssbundet, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH) som tillater genomsøking av RNA-interaksjoner in vivo på en upartisk måte. SPLASH benytter in vivo tverrbinding, nærliggende ligering og høy gjennomstrømningssekvensering for å identifisere intramolekylære og intermolekylære RNA-baseparingspartnere globalt. SPLASH kan brukes på forskjellige organismer, inkludert bakterier, gjær og humane celler, samt aS mangfoldige cellulære forhold for å lette forståelsen av dynamikken til RNA-organisasjonen under ulike cellulære sammenhenger. Hele eksperimentelle SPLASH-protokollen tar omtrent 5 dager å fullføre, og beregningsarbeidet tar omtrent 7 dager å fullføre.

Introduction

Å studere hvordan makromolekyler brettes og samhandler med hverandre er nøkkelen til å forstå genregulering i cellen. Mens mye innsats har vært fokusert i det siste tiåret på å forstå hvordan DNA og proteiner bidrar til genregulering, er relativt mindre kjent om post-transkripsjonell regulering av genuttrykk. RNA bærer informasjon i både sin lineære sekvens og i sin sekundære og tertiære struktur ¹ . Dens evne til å basere par med seg selv og med andre er viktig for sin funksjon in vivo . Nylige fremskritt i RNA sekundære strukturundersøkelser med høy gjennomstrømning har gitt verdifull innsikt i plasseringene av dobbelt- og enkeltstrengede regioner i transkriptom ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer informasjon om parringssamarbeidspartnerne mangler fortsatt stort sett. For å avgjøre hvilken RNA-sekvens som interagerer med en annen RNA-region i transkriptomet, trenger vi global parvis informasjon.

Kartlegging av parvise RNA-interaksjoner på global, upartisk måte har tradisjonelt vært en stor utfordring. Mens tidligere tilnærminger, som for eksempel CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ og RAP ¹¹ , brukes til å identifisere RNA-interaksjoner i stor skala, kartlegger disse teknikkene vanligvis RNA-baseparing for en delmengde av RNA som enten interagerer med et bestemt protein eller RNA-art. Nylige utviklinger i å studere globale RNA-interaksjoner inkluderer metoden RPL ¹² , som ikke stabiliserer RNA-interaksjoner in vivo, og kan derfor bare fange en delmengde av in vivo- interaksjoner. For å overvinne disse utfordringene utviklet vi og andre genoom-brede, upartiske strategier til maP RNA-interaktomer in vivo ved bruk av modifiserte versjoner av tverrbindingspsoralen ^{13 , 14 , 15} . I denne protokollen beskriver vi detaljene for utførelse av S- ekventering av P- sor-nen, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), som benytter biotinylert psoralen til tverrbindingsbaseparasjons-RNAer in vivo , etterfulgt av nærliggende ligering og høy gjennomstrømningssekvensering til Identifisere RNA-baseparingspartnere genomgående ( figur 1 ) ¹⁵ .

I dette manuskriptet beskriver vi trinnene for å utføre SPLASH ved hjelp av dyrkede adherente celler, i dette tilfellet HeLa-celler. Den samme protokollen kan lett tilpasses til suspensjonspattedyrceller og til gjær- og bakterieceller. Kort fortalt behandles HeLa-celler med biotinylert psoralen og bestråles ved 365 nm for å krysse sammenvirkende RNA basepar in vivo.. RNAene ekstraheres deretter fra cellene, fragmentert og anriket for tverrbundende regioner ved bruk av streptavidinperler. Interaktive RNA-fragmenter blir deretter ligert sammen ved bruk av nærliggende ligering og gjort til et cDNA-bibliotek for dyp sekvensering. Ved sekvensering er de kimære RNAene kartlagt på transkriptomet / genomet for å identifisere RNA-interaksjonsregioner som er parret til hverandre. Vi har vellykket utnyttet SPLASH for å identifisere tusenvis av RNA-interaksjoner in vivo i gjær og forskjellige humane celler, inkludert intramolekylær og intermolekylær RNA-baseparing i forskjellige klasser av RNA, som snoRNA, lncRNA og mRNA, for å glimt inn i strukturorganisasjonen og samspillsmønstre Av RNA i cellen.

Protocol

1. Behandling av HeLa-celler med biotinylert psoralen og RNA-ekstraksjon Kultur HeLa-celler i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin (PS) i en 10 cm plate. Vask HeLa-cellene to ganger med 5 ml 1x PBS. Drenk overflødig PBS helt fra parabolen ved å plassere fatet vertikalt i 1 min. Tilsett 1 ml PBS som inneholder 200 μM biotinylert psoralen og 0,01% vekt / volum digitonin, til cellene jevnt og inkuber ved 37 ° C i 5 …

Representative Results

Figur 1 viser skjematisk av SPLASH-arbeidsflyten. Ved tilsetning av biotinylert psoralen i nærvær av 0,01% digitonin og UV-tverrbinding ekstraheres totalt RNA fra cellene og en dot blot utføres for å sikre at tverrbinding av biotinylert til RNA har skjedd effektivt ( figur 2 ). Vi bruker biotinylerte 20 basoligoser som positive kontroller for å titrere mengden av biotinylert psoralen som skal tilsettes til cellene, slik at …

Discussion

Her beskriver vi i detalj den eksperimentelle og beregningsfulle arbeidsflyten for SPLASH, en metode som gjør at vi kan identifisere parvise RNA-interaksjoner på en genom-bred måte. Vi har vellykket utnyttet SPLASH i bakterielle, gjær og menneskelige kulturer og forventer at strategien kan brukes allment til ulike organismer under forskjellige celletilstander. En av de kritiske trinnene i protokollen er å starte med minst 20 μg tverrbundet RNA for å ha tilstrekkelig materiale til nedstrøms prosesser. RNAet blir …

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer:
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA
3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG