측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소
Summary
이 프로토콜은 또한 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 결정하기 위해 사용될 수있다 화학 유인 물질에 응답하여 세포 이동을 측정하는 방법을 자세히 맞춤형.
Abstract
세포 이동은 면역 반응, 성장 및 상처 치유의 중요한 부분이다. 세포 이동은 세포, 세포 외 매트릭스와 수용성 및 비 수용성 화학 인자 (예, 화학 유인 물질) 사이의 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정이다. 예 보이든 챔버 분석, 칸막이의 양측에 세포를 카운트함으로써 작업 등의 세포의 이동을 측정하기위한 표준 방법. 이 기술은 사용하기 쉽고; 그러나, 서로 다른 애플리케이션 작은 기하학적 변형을 제공한다. 대조적으로, 마이크로 유체 장치는 가용성 요소들 (1, 2)의 맞춤형 농도 기울기를 가진 세포의 이동을 관찰 할 수있다. 그러나, 미세 유체 기반의 분석을 만들기위한 방법을 배우기 어려울 수 있습니다.
여기서는 화학적 농도 기울기에 응답하여 세포 이동을 측정하기 위해 세포 배양 챔버를 생성하는 편리한 방법을 설명한다. 우리의 세포 마일연계 가능성 챔버 방법은 다양한 애플리케이션에 대해 세포 이동을 연구하기 위해 다양한 선형 농도 구배를 생성 할 수있다. 이 방법을 사용하는 것이 상대적으로 용이하고 일반적으로 학부 학생들에 의해 수행된다.
마이크로 챔버는 잘 페트리 접시에 최종 마이크로 챔버의 모양 아크릴 삽입을 배치하여 만들어졌습니다. 그 후, 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 삽입 위에 부었다. PDMS의가 경화시킨 후 삽입물을 제거 하였다. 이것은 어떤 원하는 모양이나 크기 우물의 생성을 허용했다. 이어서, 세포 마이크로 챔버에 첨가 될 수 있고, 가용 화제는 요구 에이전트에 아가 블록 담가 웰 중 하나에 첨가 될 수있다. 아가 블록 웰 중 하나에 첨가하고, 저속 이미지는 세포 이동을 정량화하기 위해 마이크로 챔버로 촬영 될 수있다. 이 방법의 변형이 방법 HIG을, 특정 응용 프로그램에 대해 할 수있다hly 사용자 정의 할 수 있습니다.
Introduction
In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 마이크로 챔버는 성장 인자 및 화학 유인 물질에 반응하여 세포의 이동 속도를 결정하고, 중합체 매트릭스로부터 약물의 확산 속도를 측정을 포함 목적의 다수를 위해 사용될 수있다. 이 세포를 성장 챔버의 일단에 화학 유인 물질을 배치하기 위해 마이크로 챔버를 이용할 수있다. 세포는 화학 주성 인자에 반응하여 증가하고, 세포 이동은 세포의 이동 속도를 결정하기 위해 분석 될 수있다 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로젝트에 자금을 제공하는 클렘 슨 대학의 크리 에이 티브 귀하의 프로그램과 NSF CBET1254609을 인정합니다.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa LASER | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
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