A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Summary

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

Abstract

A migração celular é uma parte vital da resposta imune, crescimento e cicatrização de feridas. A migração celular é um processo complexo que envolve interacções entre células, a matriz extracelular e factores químicos solúveis e não solúveis (por exemplo, quimioatractores). Métodos padrão para medir a migração de células, tais como o ensaio de câmara de Boyden, trabalho por contagem de células em ambos os lados de uma divisória. Estas técnicas são fáceis de utilizar; no entanto, eles oferecem pouca modificação geométrica para diferentes aplicações. Em contraste, os dispositivos microfluidicos podem ser utilizados para observar a migração de células com gradientes de concentração personalização de factores solúveis ^{1, 2.} No entanto, os métodos para fazer os ensaios com base microfluidos pode ser difícil de aprender.

Aqui, nós descrevemos um método fácil para criar câmaras de cultura de células para medir a migração celular em resposta a gradientes de concentração química. Nossos mi celularesmétodo câmara gração pode criar diferentes gradientes de concentração linear de modo a estudar a migração de células para uma variedade de aplicações. Este método é relativamente fácil de usar e é normalmente realizada por alunos de graduação.

A câmara de microcanais foi criado por colocação de uma inserção de acrílico na forma da câmara de microcanais finais bem em uma placa de Petri. Depois disso, o poli (dimetilsiloxano) (PDMS) foi deitada no topo da inserção. O PDMS foi deixada endurecer e, em seguida, a inserção foi removida. Isto permitiu a criação de cavidades em qualquer forma ou tamanho desejado. As células podem ser posteriormente adicionado à câmara de microcanais, e agentes solúveis podem ser adicionados a um dos poços por imersão de um bloco de agarose, o agente desejado. O bloco de agarose é adicionado a um dos poços, e as imagens de lapso de tempo pode ser feita da câmara de microcanal, a fim de quantificar a migração celular. Variações deste método pode ser feita para uma dada aplicação, tornando este método highly personalizável.

Introduction

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix³. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors⁴. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration⁵. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.

Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells⁶. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants⁷. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells⁴. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.

To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients¹. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

Protocol

1. Produzir uma Câmara MicroChannel criar um gradiente de concentração Cortando uma peça de molde de acrílico Obter um pedaço de acrílico com a largura desejada. Normalmente, utilizam 1 placas de acrílico /-16 polegadas de espessura. folhas mais espessas são difíceis de cortar bem e muito finas folhas não têm a resistência mecânica, causando-lhes a quebrar ou deformar durante o processo. Criar um ficheiro CAD com a forma desejada da peça de acrílico para pro…

Representative Results

A Figura 2 mostra o movimento da parte dianteira da célula através do canal em resposta a um gradiente de soro fetal de bovino colocado na extremidade oposta do canal, de onde as células são plaqueadas. A parte dianteira da célula é mostrada em 48 h (Figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) pós chapeamento. O movimento da frente de celular foi rastreado com estas imagens…

Discussion

A nossa câmara de microcanal pode ser utilizado para uma variedade de fins, incluindo a determinação da taxa de migração celular em resposta a factores de crescimento e quimioatractores e medindo a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero. É possível utilizar a câmara de microcanais para crescer as células e colocar um quimioatractor numa extremidade da câmara. As células crescem em resposta ao quimioatraente, e a migração de células pode ser quantificada tomando imagens de lapso…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036	poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent
Acrylic Sheets	US Plastic	44200
Disposable Petri Dishes	Falcon	25373-041
Fluorescein isothiocyanate–dextran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Fisher Scientific	11965092	Cell media components
Fetal Bovine Serium	Fisher Scientific	16000036	Cell media components
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15140148	Cell media components
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrument used for taking time-lapse images
Versa LASER	Universal Laser Systems, Inc.	Model number VLS2.30	Laser cutter used for cutting plastic