Ce protocole décrit en détail une méthode personnalisable pour mesurer la migration cellulaire en réponse à des chimioattracteurs qui peuvent également être utilisés pour déterminer le débit d'un médicament par diffusion hors d'une matrice de polymère.
La migration cellulaire est une partie essentielle de la réponse immunitaire, la croissance et la cicatrisation des plaies. La migration cellulaire est un processus complexe qui fait intervenir des interactions entre les cellules, la matrice extracellulaire et des facteurs chimiques solubles et non solubles (par exemple, chemoattractants). méthodes standard pour la mesure de la migration des cellules, telles que le dosage de la chambre de Boyden, le travail en comptant les cellules de part et d'autre d'un diviseur. Ces techniques sont faciles à utiliser; cependant, ils offrent peu de modification géométrique pour différentes applications. En revanche, les dispositifs microfluidiques peuvent être utilisés pour observer la migration des cellules avec des gradients de concentration personnalisables des facteurs solubles 1, 2. Cependant, des procédés de fabrication des tests microfluidique à base peuvent être difficiles à apprendre.
Ici, nous décrivons une méthode simple pour la création de chambres de culture cellulaire pour mesurer la migration cellulaire en réponse à des gradients de concentration du produit chimique. Nos mi cellulairesMéthode de la chambre gration peut créer différents gradients de concentration linéaire, afin d'étudier la migration des cellules pour une variété d'applications. Cette méthode est relativement facile à utiliser et est généralement effectuée par des étudiants de premier cycle.
La chambre de microcanaux a été créée en plaçant un insert acrylique en forme de la chambre de microcanaux finale bien dans une boîte de Pétri. Après cela, le poly (diméthylsiloxane) (PDMS), a été versé sur le dessus de l'insert. Le PDMS a été autorisé à durcir, puis l'insert a été retiré. Cela a permis la création de puits dans toute forme ou taille souhaitée. Les cellules peuvent ensuite être ajoutés à la chambre à micro-canaux, et des agents solubles peuvent être ajoutés à l'un des puits par trempage d'un bloc d'agarose à l'agent désiré. Le bloc d'agarose est ajouté à l'un des puits, et les images en accéléré peut être pris de la chambre de microcanaux afin de quantifier la migration cellulaire. Les variations de cette méthode peut être faite pour une application donnée, ce qui rend cette méthode highly personnalisable.
In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.
Notre chambre à micro-canaux peut être utilisé pour une multitude de fins, y compris la détermination du taux de migration cellulaire en réponse à des facteurs de croissance et chimioattractifs et en mesurant le taux d'un médicament par diffusion à partir d'une matrice de polymère. Il est possible d'utiliser notre chambre à microcanaux pour cultiver des cellules et placer un facteur chimiotactique à une extrémité de la chambre. Les cellules se développent en réponse à la chimiotactique, et la…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent le programme d'enquête Creative de l'Université Clemson et NSF CBET1254609 pour fournir un financement pour ce projet.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
Versa LASER | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |