Intracellulær Farging og flowcytometri for å identifisere Lymfocytt Delsett i Murine Aorta, Nyre og lymfeknuter i en Model of Hypertension
Summary
Denne artikkelen gir detaljert metode for å identifisere og kvantifisere funksjonelle T lymfocytt undergrupper stede i murine nyre, aorta og lymfeknuter ved intracellulær farging og flowcytometri. Modellen av angiotensin II indusert hypertensjon ble valgt til å forklare, steg-for-steg, prosedyrer og grunnleggende prinsipper for flowcytometri og intracellulær farging.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
Nyere bevis viser at det adaptive immunsystemet, spesielt T-lymfocytter, spiller en avgjørende rolle i utviklingen av en rekke kardiovaskulære sykdommer 1,2,3,4,5. For eksempel, i modellen av angiotensin II-indusert hypertensjon, en akkumulering av T-celler i skip og nyrene hos mus er blitt beskrevet seks. Den vaskulære opphopning er hovedsakelig i adventitia og perivaskulær fett. I nyrene, T-celler akkumuleres i både medulla og nyrebarken. Avhengig av hvilken undergruppe er involvert, er disse T-cellene gir opphav til forskjellige cytokiner som kan påvirke vaskulær og nyrefunksjon og føre til utvikling av patologi (gjennomgått av McMaster et al. 6).
CD4 + T-hjelper-lymfocytter kan deles inn i flere undergrupper: T-hjelper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, T regulatoriske (treg) celler, og T-hjelper follikulær (TFH) celler basert på deres funksjoner og signatur cytomegaloviruskines 7. På samme måte kan CD8 + cytotoksiske T-celler kan klassifiseres som TC1, TC2, Tc17 eller TC9 8. Det er også doble negative T-celler (dvs. celler som ikke uttrykker CD4 eller CD8 T-cellemarkører). En undergruppe av disse cellene har en alternativ gamma delta T-celle-reseptor (i stedet for de klassiske alfa- og beta-reseptorer) og er derfor referert til som gamma delta T-celler. Den multiparametriske analyse ved flowcytometri av overflatemarkør, cytokin og transkripsjonsfaktor som utgjør den beste tilnærming for å identifisere disse celler. Selv om denne metoden er mye brukt innen immunologien, er det mindre godt beskrevet i faste organer og i innstillingen av kardiovaskulære sykdommer.
Historisk ble identifisering av lymfocytter i vev er begrenset til immunhistokjemi eller RT-PCR-metoder. Selv immunhistokjemi og immunfluorescens er kraftige metoder for å bestemme vevet distribusjon av et antigen av interest, de er utilstrekkelig for å fenotypisk identifisere undergrupper involvert. I tillegg, mens RT-PCR-analyse er nyttig for å detektere mRNA ekspresjon av antigener, cytokiner eller transkripsjonsfaktorer, det tillater ikke påvisning av multiple proteiner samtidig på nivået av individuelle celler.
Ankomsten av flowcytometri, spesielt kombinert med intracellulær farging for å påvise cytokiner og transkripsjonsfaktorer, gir etterforskere med en kraftfull teknikk som gjør identifisering og kvantifisering på celle nivå av immuncelle undergrupper i solide organer. Vi har optimalisert en intracellulær farging assay for å identifisere ved hjelp av strømningscytometri de store T-celle-undersett til stede i muse-nyre, aorta og aorta drenerende lymfeknuter i en modell av angiotensin II-indusert hypertensjon. Optimaliseringen av hvert trinn: vevsfordøyelse, ex vivo-aktivering, permeabiliseringen, og overflaten og intracellulære fargingsresultater i et høyt reproduser analyse som kan anvendes for andre kardiovaskulære og renale sykdomsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) til FL, en trening bevilgning fra National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) til BLD, en American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) til MA Saleh, og en NIH K08 award (HL121671) til MSM. MSM er også støttet av en forskningsstipend fra Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
