Intracellulär färgning och flödescytometri för att identifiera lymfocytundergrupper inom Murina Aorta, njure och lymfkörtlar i en modell of Hypertension
Summary
Den här artikeln innehåller detaljerad metod för att identifiera och kvantifiera funktionella T-lymfocyter delmängder finns inom mus njure, aorta och lymfkörtlar genom intracellulär färgning och flödescytometri. Modellen av angiotensin II hypertoni valdes för att förklara, steg-för-steg, förfaranden och grundläggande principer för flödescytometri och intracellulär färgning.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
Nya bevis visar att det adaptiva immunsystemet, särskilt T-lymfocyter, spelar en avgörande roll i utvecklingen av flera kardiovaskulära sjukdomar 1,2,3,4,5. Till exempel, i modellen av angiotensin Il-inducerad hypertoni, en ackumulering av T-celler i kärlen och njurar från möss har beskrivits 6. Den vaskulära ansamling är främst i adventitia och perivaskulära fett. I njuren, T-celler ackumulerar i både märgen och njurbarken. Beroende på vilken undergrupp är involverad, är dessa T-celler ger upphov till olika cytokiner som kan påverka kärl- och njurfunktionen och leder till utveckling av patologi (översikt av McMaster et al. 6).
CD4 + T-hjälparce lymfocyter kan indelas i flera undergrupper: T-hjälparce 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, T regulatoriska (Treg) celler, och T follikulära hjälpar (TFH) celler baserat på deras funktioner och signatur cytokines 7. På samma sätt kan CD8 + cytotoxiska T-celler klassificeras som TC1, TC2 Tc17 eller TC9 8. Det finns också dubbelnegativa T-celler (dvs celler som inte uttrycker CD4 och CD8 T-cellmarkörer). En undergrupp av dessa celler har en alternativ gamma delta T-cellreceptorn (i stället för de klassiska alfa- och beta-receptorer) och därför hänvisas till som gamma delta-T-celler. Multiparameteranalys med flödescytometri av ytmarkör, cytokin och transkriptionsfaktor utgör det bästa sättet att identifiera dessa celler. Även om denna metod används i stor utsträckning inom området för immunologi, är det mindre väl beskrivna i fasta organ och i fastställandet av kardiovaskulära sjukdomar.
Historiskt sett var identifieringen av lymfocyter i vävnader begränsad till immunohistokemi eller RT-PCR-metoder. Även immunohistokemi och immunofluorescens är kraftfulla metoder för att bestämma vävnadsfördelningen av ett antigen av interest, de är otillräckliga för att fenotypiskt identifiera undergrupper är inblandade. Dessutom medan RT-PCR-analys är användbar för att detektera mRNA-expression av antigener, cytokiner eller transkriptionsfaktorer, det tillåter inte detektion av multipla proteiner samtidigt på nivån för enskilda celler.
Tillkomsten av flödescytometri, särskilt i kombination med intracellulär färgning att upptäcka cytokiner och transkriptionsfaktorer, ger utredarna med en kraftfull teknik som möjliggör identifiering och kvantifiering på enskild cellnivå av immuncellundergrupper i fasta organ. Vi har optimerat en intracellulär färgning analys för att identifiera med flödescytometri de stora T-cell-underuppsättningar som finns inom murint njure, aorta och aorta dränerande lymfkörtlar i en modell av angiotensin Il-inducerad hypertoni. Optimeringen av varje steg: vävnad matsmältningen, ex vivo aktivering, permeabilization och yta och intracellulär färgning resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan tillämpas på andra modeller kardiovaskulära och njursjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) till FL, en utbildningsstipendium från National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) till BLD, en American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) MA Saleh, och en NIH K08 utmärkelse (HL121671) till MSM. MSM stöds också av ett forskningsbidrag från Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
