살아있는 세포를 엔지니어하는 합성 생물학을 사용하여 해당 프로그램 자료와 인터페이스
Summary
이 논문은 조작 된 세포와 합성 제어 프로그램 재료 표면을 조작하는 대장균을 설계 에이블 작용 표면을 개발하기위한 프로토콜의 시리즈를 제공합니다.
Abstract
우리는 설계 세포 관능 표면의 물성을 제어 할 수있는 생물 적 생물 – 인터페이스를 개발했다. 대장균의 합성 조작 된 균주 및 관능 재 계면이 시스템은 두 개의 모듈을 생성함으로써 만들어진다. 이 논문에서, 우리는 세부 유전자 분자 복제 전략을 사용하여 대장균의 균주 내에서 선택 행동을 설계하기위한 프로토콜. 화학 유도제에 노출 될 때 회 전개,이 균주는 바이오틴의 높은 수준을 생성한다. 또한, 세포 합성 비오틴에 응답 할 수있는 각각의 두 가지 작용 표면을 만들기위한 우리 상세히 프로토콜. 종합하면, 우리는 무생물 재료 기판 상 조성물 및 조립을 제어하는 셀을 설계 허용 연결된, 비 생물 – 생물학적 시스템을 생성하는 방법을 제시한다.
Introduction
여기서, 우리는 조작 세포주에서 화학적 신호에 응답 할 수있는 프로그래밍이 된 기판을 현상하는 절차를보고한다. (1) 우리는 합성 조작 된 대장균 (대장균) 세포에 의해 생성 비오틴에 응답 비오틴 – 스트렙 타비 딘 인터페이스를 작성하여이를 수행합니다. 이전 프로그램은 독소의 표면 검사 2 및 치료 시점 진단 3 방위 및 보안에서 다양한 애플리케이션을 위해 설계되었다. 프로그래머블 표면 센서 및 액추에이터로서 유용 할 수있는 4이지만, 서로 다른 환경 문제에 적응할 수있는 능력을 부여하는로 '똑똑한'할 수있다. 대조적으로, 대장균 심지어 간단한 미생물은 본래 적응성이 있고 정교 종종 예기치 솔루션 과제에 응답 할 수있다. 이 적응성은 E. 사용할 수있다복잡한 유전자 네트워크에 의해 제어 대장균 인구는 비용 효율적으로 자원을 찾아, 5 부가가치 제품, 6, 심지어 전원 마이크로 규모의 로봇을 만들 수 있습니다. 7 프로그래밍 표면을 이용하여 살아있는 세포의 적응 효과를 결합함으로써, 우리는 상이한 환경 조건에 응답 할 수있는 스마트 기판을 생성 할 수있다.
합성 생물학은 생물의 행동을 프로그래밍하는 연구자들에게 새로운 능력을 부여하고있다. 새로운 유전자 조절 네트워크를 포함하는 셀을 설계함으로써, 연구자들은 프로그래밍 동작의 범위를 나타내는 셀을 설계 할 수있다. 기초 연구 너머 (8, 9)는, 이러한 동작은 부가가치 제품을 재 조립을 제어 생물학적 생산과 같은 애플리케이션에 사용될 수있다. 10 여기, 우리가 합성 생물학의 도구를 사용하여 우리 세부 방법 엔유도에 비오틴 합성 대장균 균주 때문에 엔지니어. 이 균주는 플라스미드 pKE1-의 lacI-bioB 조립 제한 효소 클로닝 방법을 사용하여 개발되었다. 대장균 균주 K-12 MG1655로 변환 할 때, 플라스미드는 bioB 비오틴 합성에 필수적인 효소의 상승 된 수준을 발현하는 능력을 부여한다 세포. 형질 전환 된 세포가 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 사이드 (IPTG)를 유도 비오틴 전구체 desthiobiotin (DTB)가 제공되었을 때, 비오틴의 높은 수준이 생성되었다.
스트렙 타비 딘과 비오틴의 결합 상호 작용은 자연에서 발견 강한 비 공유 결합 중 하나입니다. 이와 같이, 비오틴 – 스트렙 트 아비딘 상호 작용은 잘 특성화 높은 바이오 채용 모두이다. 이 원고 (11) 내에서, 우리는 감지 관능면 셀 생산 바이오틴을 검출 바이오틴 – 스트렙 상호 작용을 이용하는 두 가지 전략을 제시한다. 우리"간접적"와 "직접"제어 방식으로 이러한 대조적 인면을 참조하십시오. 간접 제어 방식에서, 셀 생산 바이오틴이 결합하고 결합 부위를 스트렙 타비 딘을위한 폴리스티렌 표면 상에 고정화 된 바이오틴 경쟁. 또한, 스트렙 타비 딘은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)가 결합된다. HRP 3, 3 ', 5, 5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 450 nm의 (OD 450)에서 스펙트럼의 흡광도 (즉, 광학 밀도)을 정량함으로써 모니터링 될 수있는 광 신호 (12)를 생성하기 위하여 변경한다. 따라서, 간접적 인 제어 방식이 연구는 OD 450 attentuation 신호를 모니터링하여 셀 생산 비오틴을 측정 할 수있다.
직접 제어 방식은 재료 표면에 직접 스트렙 타비 딘을 고정화 및 결합 부위를 스트렙 타비 딘 경쟁하는 셀 생산 비오틴 및 비오틴 HRP를 허용하여 스트렙 타비 딘 – 비오틴 이벤트를 이용한다. 다시,셀 생산 비오틴의 상대적 수준은 OD 450 신호를 측정하여 모니터링됩니다.
함께 찍은, 조작 된 세포와 기능화 된 표면은 우리가 살아있는 세포에 네트워크를 유도하여 프로그램 표면의 특성을 제어 할 수 있습니다. 즉, 우리는 함께 이러한 시스템을 연결하여 조작 재 계면의 생물체의 적응성과 신뢰성 사양을 활용하는 시스템을 만들었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 작용 물질의 표면과 생활 설계 세포를 인터페이스하기위한 새로운 전략을 발표했다. 이 IPTG로 유도 할 때 비오틴 수준 상승을 합성 할 수있는 세포주를 개발함으로써 달성되었다. 비오틴의 상승 된 수준은 기능화 된 표면을 수정하는 데 사용될 수있다. 프로토콜은 대장균 세포 라인을 설계하는 방법에 두 가지 작용 표면을 생성하는 방법을 상세히.
이 프로토콜…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기꺼이 미국의 과학 연구의 공군 사무실에서 수상 FA9550-13-1-0108 지원을 인정합니다. 저자는 또한 버지니아 폴리 테크닉 연구소 및 주립 대학에서 중요한 기술 및 응용 과학 연구소에서와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구에서 자금, 미국의 해군 연구소의 사무실에서 수상 N00014-15-1-2502의 지원을 인정 원정대 프로그램, 보너스 번호 1607310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
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