Brug Syntetisk Biologi Engineer levende celler der Grænseflade med Programmable Materials
Summary
Denne artikel præsenterer en række protokoller til at udvikle manipulerede celler og funktionaliserede overflader, der muliggør syntetisk manipuleret E. coli til at kontrollere og manipulere programmerbare materiale overflader.
Abstract
Vi har udviklet en abiotisk-biotiske interface, der tillader manipulerede celler for at kontrollere materialeegenskaber en funktionaliseret overflade. Dette system er lavet ved at skabe to moduler: et syntetisk manipuleret stamme af E. coli-celler og en funktionaliseret materiale interface. Inden dette papir, vi detalje en protokol for gensplejsning af udvalgte adfærd inden for en stamme af E. coli ved hjælp af molekylær kloning strategier. Når udviklet, denne stamme producerer forhøjede niveauer af biotin når den udsættes for en kemisk inducer. Desuden har vi detalje protokoller for at oprette to forskellige funktionaliserede overflader, som hver især er i stand til at reagere på celle-syntetiserede biotin. Tilsammen præsenterer vi en metode til at skabe en sammenkædet, abiotisk-biotiske system, der tillader manipulerede celler til kontrol materialesammensætningen og montage på ikke levende substrater.
Introduction
Her rapporterer vi procedurerne for at udvikle en programmerbar substrat i stand til at reagere på et kemisk signal fra en manipuleret celle linje. 1 Det gør vi ved at skabe en biotin-streptavidin grænseflade, der reagerer på biotin produceret af celler syntetisk manipuleret Escherichia coli (E. coli). Tidligere har programmerbare overflader blevet udviklet til en bred vifte af applikationer fra toksin afsløring 2 og point-of-care diagnostik 3 til forsvar og sikkerhed. 4 Mens programmerbare overflader kan være nyttige som sensorer og aktuatorer, kan de gøres "smartere" ved at give dem mulighed for at tilpasse sig forskellige miljøudfordringer. I modsætning hertil selv simple mikroorganismer, såsom E. coli, har iboende tilpasningsevne og er i stand til at reagere på udfordringer med avancerede og ofte uventede løsninger. Denne tilpasningsevne har gjort det muligt E.coli befolkninger, der kontrolleres af deres komplekse gen netværk, på en omkostningseffektiv måde søger ressourcer, 5 skabe værdiskabende produkter, 6 og endda magt mikro-skala robotteknologi. 7 Ved at koble de adaptive fordele ved levende celler med brug af programmerbare overflader, kan vi skabe en smart substrat i stand til at reagere på forskellige miljøforhold.
Syntetisk biologi har givet forskere nye evner til at programmere adfærd levende organismer. By engineering celler til at indeholde nye gen regulatoriske netværk, kan forskerne designe celler, der udviser en række programmerede adfærd. 8, 9 Beyond grundforskning, kan disse adfærdsmønstre anvendes til applikationer såsom kontrollere materiale samling og biologisk producerer forædlede produkter. 10 Heri vi detaljer, hvordan vi brugte de værktøjer syntetisk biologi til engineer en E. coli stamme, der syntetiserer biotin efter induktion. Denne stamme blev udviklet ved anvendelse af restriktionsenzym kloningsmetoder at samle et plasmid, pKE1-lacI-bioB. Dette plasmid, når det blev transformeret ind i E. coli stamme K-12 MG1655, forlener celler med evnen til at udtrykke forhøjede niveauer af bioB, et essentielt enzym til biotin syntese. Når transformerede celler blev induceret med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) og er forsynet med en biotin-precursor, desthiobiotin (DTB), blev forhøjede niveauer af biotin produceret.
Biotin er bindende interaktion med streptavidin er en af de stærkeste ikke-kovalente bindinger findes i naturen. Som sådan biotin-streptavidin interaktion er både velkarakteriserede og højt ansat i bioteknologi. 11 Inden for dette manuskript, præsenterer vi to strategier anvender biotin-streptavidin interaktion til at sanse og opdage celle-producerede biotin med en funktionaliseret overflade. Vihenvise til disse modsatrettede overflader som "indirekte" og "direkte" kontrol ordninger. I indirekte kontrol ordning, celle-produceret biotin konkurrerer med biotin, som er blevet konjugeret og immobiliseres på en polystyren-overflade til streptavidin bindingssteder. Desuden er streptavidin konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP). HRP modificerer 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidin (TMB), til frembringelse af et optisk signal, 12, som kan overvåges ved kvantificering af spektrale absorbans (dvs. optisk densitet) ved 450 nm (OD 450). Således kontrolsystem indirekte tillader forskerne at måle celle-produceret biotin ved at overvåge attentuation af OD450 signal.
Ordningen direkte kontrol udnytter streptavidin-biotin begivenhed ved at immobilisere streptavidin direkte til et materiale overflade og tillade celle-producerede biotin og biotinyleret HRP til at konkurrere om streptavidin bindingssteder. Igen,relative niveauer af celle-produceret biotin overvåges ved at måle en OD 450 signal.
Tilsammen de manipulerede celler og funktionaliserede overflader tillade os at kontrollere egenskaberne af en programmerbar overflade ved at inducere net i levende celler. Med andre ord, har vi skabt et system, der drager fordel af tilpasningsevne levende organismer, og pålideligheden og specifikation af en manipuleret materiale grænseflade ved at koble disse systemer sammen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har præsenteret en ny strategi for sammenknytning manipuleret levende celler med et funktionaliseret materiale overflade. Dette blev opnået ved at udvikle en cellelinie stand til at syntetisere forøgede niveauer af biotin ved induktion med IPTG. De forhøjede niveauer af biotin kan derpå anvendes til at modificere den funktionaliserede overflade. Protokollerne detaljeret hvordan at ingeniør E. coli cellelinje og hvordan man skaber to forskellige funktionaliserede overflader.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker støtte fra award FA9550-13-1-0108 fra Air Force Office of Scientific Research i USA. Forfatterne derudover anerkender støtte fra award N00014-15-1-2502 fra Office of Naval Research i USA, finansiering fra Institut for Kritisk Teknologi og Applied Science på Virginia Polytechnic Institute og State University, og fra National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, tildeling nummer 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
